W związku z lawinowo rosnącą liczbą zachorowań na COVID-19 głównym celem jest obecnie zahamowanie dalszego szerzenia się infekcji i jak najszybsze wykrywanie nowych przypadków. W tym celu, zgodnie z zaleceniami WHO, wykonuje się testy molekularne (RT-PCR). Służą one do potwierdzenia obecności materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w materiale pobranym od pacjenta. Testy genetyczne oparte o metodę RT-PCR pozwalają na detekcję wirusa nawet przed upływem 7 dni od momentu zakażenia, czyli jeszcze przed wystąpieniem pierwszych objawów klinicznych. Z filmu dowiesz się, jak wygląda diagnostyka molekularna infekcji SARS-CoV-2, z jakich etapów składa się badanie genetyczne, czym jest strategia podwójnego celu i w jaki sposób wpływa na czułość i specyficzność badania.

0:40 W jaki sposób potwierdza się zakażenie SARS-CoV-2?

2:29 Jak działa test genetyczny EURORealTime SARS-CoV-2?

4:07 Co wykrywa test genetyczny EURORealTime SARS-CoV-2?

5:59 Czy metoda RT-PCR ma jakieś ograniczenia w rozpoznawaniu zakażenia nowym koronawirusem?

7:12 Na jakim etapie infekcji SARS-CoV-2 badania genetyczne mają największe znaczenie?

8:18 Podsumowanie

Informacje przedstawione w filmie pochodzą z artykułów:

World Health Organization. Laboratory testing for coronavirus disease ( COVID-19) in suspected human cases: interim guidance, 19 March 2020. [Online] https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/331501/WHO-COVID-19-laboratory-2020.5-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y.

Zhao J. i wsp. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. medRxiv (Preprint). [Online] 2020. doi: 10.1101/2020.03.02.20030189.

Badania potwierdzające zakażenie SARS-CoV-2

COVID-19 (ang. Coronavirus Disease 2019) to zakaźna choroba wywoływana przez nowego koronawirusa, czyli SARS-CoV-2, który został odkryty pod koniec 2019 r. w chińskim mieście Wuhan. Do tej pory (stan na 14.04.2020) na całym świecie odnotowano blisko 2 miliony przypadków, z których ponad 120 tysięcy zakończyło się śmiercią pacjenta. Lawinowo rosnąca liczba nowych zachorowań, szczególnie w Europie, która stała się obecnie epicentrum tej choroby, sprawiła, że Światowa Organizacja Zdrowia (World Health Organization, WHO) 11 marca 2020 r. ogłosiła stan pandemii COVID-19. W związku z tym zahamowanie dalszego szerzenia się infekcji spowodowanej przez SARS-CoV-2 stało się głównym celem wielu krajów na całym świecie.

Jak można odróżnić COVID-19 od innych chorób, takich jak grypa?

Do najczęstszych objawów infekcji SARS-CoV-2 zaliczamy gorączkę, kaszel, trudności z oddychaniem i zmęczenie. U niektórych chorych, szczególnie u osób starszych lub cierpiących z powodu przewlekłych chorób, rozwija się ciężki zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), który wymaga mechanicznego wspomagania oddychania. U części pacjentów ARDS kończy się śmiercią.

Niedawno pojawiły się badania naukowe, które wskazują, że u części osób zakażonych nowym koronawirusem nie występują objawy ze strony układu oddechowego. Ponadto część zakażonych przechodzi infekcję bezobjawowo lub skąpo objawowo. Takie osoby mogą być źródłem infekcji dla innych ludzi – są to tzw. „cisi” nosiciele.

Z powodu braku specyficznych objawów rozpoznanie choroby tylko w oparciu o obraz kliniczny jest niemożliwe. Aby wiarygodnie potwierdzić COVID-19, konieczne jest wykonanie badań laboratoryjnych.

W jaki sposób potwierdza się zakażenie?

W obecnej sytuacji epidemiologicznej najbardziej istotne dla zahamowania rozprzestrzeniania się SARS-CoV-2 jest jak najszybsze wykrywanie infekcji. Zgodnie z zaleceniami Światowej Organizacji Zdrowia rozpoznanie infekcji SARS-CoV-2 wymaga potwierdzenia obecności materiału genetycznego wirusa w materiale pobranym od pacjenta, czyli NAAT (NAAT – Nucleic Acid Amplification Tests). Do technik amplifikacji kwasu nukleinowego zaliczamy metodę RT-PCR, która jest powszechnie stosowana w diagnostyce zakażeń SARS-CoV-2. Testy genetyczne oparte o metodę RT-PCR pozwalają na detekcję wirusa nawet przed upływem 7 dni od momentu zakażenia, czyli jeszcze przed wystąpieniem pierwszych objawów klinicznych. Badania genetyczne najwyższą czułość uzyskują między 7. a 14. dniem od kontaktu z SARS-CoV-2 (czyli wówczas, gdy pacjent ma już pierwsze objawy zakażenia). Materiałem do badań są wymazy z górnych dróg oddechowych i/lub próbki pobrane z dolnych dróg oddechowych (np. aspiraty przeztchawicze oraz popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe).

Zaletami diagnostyki bezpośredniej opartej o metodę RT-PCR są:

• możliwość otrzymania wyników dodatnich przed wystąpieniem pierwszych objawów klinicznych
• możliwość otrzymania wyników dodatnich również u pacjentów, u których zakażenie przebiega bezobjawowo lub skąpo objawowo
• niskie ryzyko wystąpienia reakcji krzyżowych (oczywiście przy odpowiednim doborze starterów do reakcji)

Jak działa test genetyczny EURORealTime SARS-CoV-2?

Materiałem do badania genetycznego jest wymaz z górnych dróg oddechowych. Pierwszym krokiem jest izolacja RNA wirusa z próbki pacjenta według instrukcji dołączonej do zestawu do izolacji. Następnie przystępujemy do wykonania oznaczenia.

Test EURORealTime SARS-CoV-2 oparty jest o reakcję odwrotnej transkrypcji, czyli proces przepisywania jednoniciowego RNA wirusa na dwuniciowy cDNA. Jest to pierwszy etap reakcji. cDNA jest w dalszej kolejności powielane w reakcji PCR. Ostatni etap to detekcja (w czasie rzeczywistym) 2 zdefiniowanych wysokospecyficznych obszarów genomu wirusa SARS-CoV-2 przy użyciu fluorescencyjnych znaczników.

W przypadku testu EURORealTime SARS-CoV-2 oba regiony genetyczne wykrywane są równolegle w pojedynczym biegu testowym, co znacząco skraca czas oczekiwania na wynik.

Test EURORealTime SARS-CoV-2 jest szybki i łatwy w wykonaniu:

• umożliwia wykonanie oznaczeń dla 100 próbek
• czas oznaczenia to 80 minut
• wszystkie niezbędne do wykonania oznaczenia odczynniki są zawarte w zestawie i są gotowe do użycia

Co wykrywa test genetyczny EURORealTime SARS-CoV-2?

Wykrywanie materiału genetycznego nowego koronawirusa za pomocą testu EURORealTime SARS-CoV-2 opiera się na strategii podwójnego celu. Oznacza to, że w jednej reakcji analizuje się równolegle obecność 2 sekwencji genetycznych genomu wirusa SARS-CoV-2. Są to 2 regiony: ORF1ab i N-Gen. Co nam to daje?

Strategia podwójnego celu zapewnia nam najwyższą czułość i specyficzność badania. Zastosowanie analizy 2 sekwencji zapewnia wyższą czułość badania w porównaniu do badania pojedynczych sekwencji. Ponadto taka konstrukcja testu to krok w stronę przyszłości. Umożliwia wykrywanie obecności wirusa nawet w przypadku pojawienia się nowych wariantów genów. Gdy mutacje wystąpią w miejscu wiązania startera lub sondy jednej sekwencji docelowej, materiał genetyczny wirusa można nadal wykryć za pomocą drugiej sondy zawartej w teście, skierowanej do drugiej sekwencji.

Regiony ORF1ab i N-Gen są wysokoswoiste dla SARS-CoV-2. Badanie genetyczne oparte o detekcję wysokospecyficznych sekwencji zapobiega reakcjom krzyżowym z innymi ludzkimi koronawirusami: 229E, OC43, NI63, SARS czy MERS.

Zastosowanie wybranych przez EUROIMMUN sekwencji skraca czas badania – wystarczy tylko 1 reakcja na próbkę. Dla porównania niektóre testy ze względu na niższą czułość oznaczenia wymagają przeprowadzenia aż 3 reakcji na próbkę w celu otrzymania wiarygodnego wyniku.

Czy metoda RT-PCR ma jakieś ograniczenia w rozpoznawaniu zakażenia nowym koronawirusem?

Materiałem do badań RT-PCR jest RNA izolowane z wymienionych wcześniej próbek. Wysoka jakość próbki RNA jest warunkiem koniecznym do otrzymania wiarygodnego wyniku. Nieprawidłowe pobranie próbki, preparacja i przechowywanie materiału genetycznego mogą prowadzić do otrzymania nieważnych lub nawet fałszywych wyników. Ponadto, ze względu na wysoką czułość analityczną metody RT-PCR, należy zwrócić szczególną uwagę i upewnić się, że składniki zestawu testowego oraz próbki pozostają wolne od zanieczyszczeń. W celu zbadania ewentualnej kontaminacji kluczowe jest stosowanie kontroli negatywnych zarówno na etapie ekstrakcji, jak i reakcji PCR.

Zestaw testowy EURORealTime SARS-CoV-2 zawiera zintegrowaną kontrolę wewnętrzną określającą poprawność przeprowadzonej ekstrakcji RNA, ewentualną inhibicję PCR oraz poprawność procesu amplifikacji. W zestawie znajdziemy również kontrolę dodatnią SARS-CoV-2, która jest wykorzystywana jako zewnętrzna kontrola w każdym przebiegu testu.

Na jakim etapie infekcji badania genetyczne mają największe znaczenie?

Zgodnie z zaleceniami WHO diagnostyka bezpośrednia oparta o metodę RT-PCR jest podstawowym narzędziem służącym do diagnozowania zakażenia SARS-CoV-2. Badania te mają najwyższą czułość w początkowej fazie infekcji, czyli między 7. a 14. dniem od kontaktu z patogenem.

Po upływie około tygodnia od wystąpienia pierwszych objawów klinicznych czułość diagnostyki molekularnej w zakażeniach SARS-CoV-2 stopniowo maleje, z powodu spadku liczby cząstek wirusa w nabłonku dróg oddechowych. Wówczas pacjent może otrzymać wynik ujemny badania RT-PCR, pomimo toczącej się infekcji.

W tej późniejszej fazie infekcji kluczowe znaczenie zaczynają odgrywać testy serologiczne wykrywające specyficzne przeciwciała anty-SARS-CoV-2, które wydają się być idealnym dopełnieniem metody RT- PCR, wydłużając czas umożliwiający przeprowadzenie wiarygodnej diagnostyki.

Podsumowanie

Rozpoznanie infekcji SARS-CoV-2 wymaga potwierdzenia obecności materiału genetycznego wirusa w materiale pobranym od pacjenta. Już dziś można wykonać badanie za pomocą testu EURORealTime SARS-CoV-2, którego zaletami są:

• równoległe oznaczanie 2 sekwencji wirusa SARS-CoV-2, co znacznie zwiększa czułość badania
• detekcja specyficznych dla nowego koronawirusa regionów genomu, co zapewnia wysoką swoistość badania, zapobiegając reakcjom krzyżowym
• szybkość i łatwość wykonania testu z użyciem ogólnodostępnego wyposażenia laboratorium genetycznego
• wiarygodność: niezbędne certyfikaty – CE oraz IVD