Wywiad z dr. Nicolą Bizzarem, specjalistą medycyny laboratoryjnej z Azienda Sanitaria Universitaria Integrata w Udine we Włoszech, uznanym ekspertem w zakresie standaryzacji badań autoimmunologicznych oraz współautorem włoskich wytycznych GdS-AI SIPMeL (Gruppo di Studio in Autoimmunologia della Società Italiana di Patologia Clinica e Medicina di Laboratorio), dotyczących diagnostyki autoimmunologicznych chorób wątroby.

Nowe włoskie wytyczne dotyczące diagnostyki autoimmunologicznych chorób wątroby stanowią ważny krok w kierunku bardziej praktycznych rozwiązań w tej dziedzinie. Jakie były główne powody aktualizacji zaleceń oraz jakie są kluczowe różnice w porównaniu z rekomendacjami EASL i IAHG?

Wytyczne praktyki klinicznej Międzynarodowej Grupy Autoimmunizacyjnego Zapalenia Wątroby (IAHG) oraz Europejskiego Towarzystwa Badań nad Wątrobą (EASL), dotyczące diagnozowania i leczenia autoimmunologicznego zapalenia wątroby, pomijają zagadnienia związane z metodami wykrywania autoprzeciwciał. Aspekty te są często zaniedbywane, ponieważ obejmują techniki i procedury laboratoryjne wykraczające poza typową praktykę kliniczną i wymagające specjalistycznego doświadczenia.

Różnice dotyczą dwóch kluczowych elementów:

• substratu do oznaczania przeciwciał przeciwjądrowych (ANA),
• początkowego rozcieńczenia stosowanego w metodach immunofluorescencji pośredniej (IIF) do wykrywania ANA, AMA, ASMA oraz przeciwciał anty-LKM.

Międzynarodowe wytyczne od lat konsekwentnie rekomendują stosowanie skrawków trzech tkanek gryzoni (wątroba, nerka i żołądek) jako substratu do wykrywania ANA u pacjentów z podejrzeniem AIH. Tymczasem już ponad trzy dekady temu większość laboratoriów immunologicznych na świecie przeszła na komórki HEp-2, które są obecnie standardem w diagnostyce ANA.

Utrzymywanie zaleceń dotyczących stosowania preparatów z tkanek gryzoni zamiast komórek HEp-2 pokazuje wyraźną rozbieżność między międzynarodowymi wytycznymi a realną praktyką laboratoryjną.

Profilowanie autoprzeciwciał odgrywa kluczową rolę w diagnostyce AIH i PBC. Które markery uważa Pan za najbardziej istotne klinicznie?

W przypadku AIH najbardziej istotne są markery zawarte w kryteriach diagnostycznych IAHG: ANA, ASMA, LKM oraz SLA.

W przypadku PBC są to AMA, przeciwciała anty-sp100 i anty-gp210.

Kluczowym punktem Pana pracy jest uczynienie wytycznych możliwymi do zastosowania w rutynowych laboratoriach. Jakie postępy technologiczne lub proceduralne mogłyby pomóc w osiągnięciu tego celu?

Nie są potrzebne żadne zmiany. Obecnie wszystkie laboratoria dysponują platformami analitycznymi, które umożliwiają oznaczanie wszystkich autoprzeciwciał wykorzystywanych w diagnostyce autoimmunologicznych chorób wątroby.

Jak ocenia Pan rolę testów multiparametrycznych, takich jak panele line-blot, w uzupełnianiu klasycznej IIF i wspieraniu diagnostyki AIH/PBC?

Testy multiparametryczne ze specjalnie dobranymi panelami antygenów są bardzo przydatne w potwierdzaniu wyników uzyskanych w badaniach przesiewowych, wykonywanych metodą IIF. Wzór AMA-podobny w IIF na komórkach HEp-2 lub wzory AMA, LKM czy ASMA na tkankach gryzoni zawsze muszą zostać potwierdzone metodami swoistymi. Należy także pamiętać, że przeciwciała anty-SLA, będące jednym z kryteriów klasyfikacyjnych AIH, nie są wykrywalne w IIF i muszą być oznaczane metodą blot lub immunoenzymatyczną.

W swoim abstrakcie porusza Pan temat progów rozcieńczeń. Jak istotne są te wartości graniczne dla zapewnienia prawidłowej interpretacji wyników i ich porównywalności między laboratoriami?

To drugi aspekt, który różni naszą propozycję od zaleceń międzynarodowych. Ponieważ rozcieńczenie ma bezpośredni wpływ na czułość i swoistość testu, stosowanie niskich progów (1:20–1:40), zalecanych w obecnych wytycznych, narażałoby na liczne wyniki fałszywie dodatnie – szczególnie u osób starszych i w trakcie przejściowych infekcji.

Uważamy, że w laboratoriach klinicznych należy stosować próg 1:80 zarówno dla ANA, jak i pozostałych autoprzeciwciał, aby zapewnić wyższą swoistość diagnostyczną.

Jakie są Pana zdaniem najpilniejsze priorytety w zakresie standaryzacji diagnostyki autoimmunizacyjnych chorób wątroby i jak można zmniejszyć rozbieżność między wytycznymi a codzienną praktyką laboratoryjną?

Standaryzacja jest zadaniem trudnym, a być może nawet niemożliwym do zrealizowania, ponieważ nie istnieje międzynarodowy standard ilościowego oznaczania autoprzeciwciał. Bardziej wykonalnym i realistycznym celem jest harmonizacja metod.

Aby wytyczne były naprawdę użyteczne, powinny być możliwe do zastosowania we wszystkich laboratoriach klinicznych, a nie tylko w jednostkach doświadczonych czy referencyjnych, które stanowią zaledwie niewielki ułamek wszystkich laboratoriów wykonujących oznaczenia autoprzeciwciał w chorobach wątroby. Tylko wtedy mogą powstać praktyczne rekomendacje dotyczące oznaczania przeciwciał, które będą mogły być wdrożone w większości laboratoriów.

Dziękuję za rozmowę.

Rozmawiała: Anna Kołtyś

Harmonization Instead of Standardization: A Practical Approach to Autoantibody Detection

Interview with Dr. Nicola Bizzaro, a laboratory medicine specialist at the Azienda Sanitaria Universitaria Integrata in Udine, Italy, a recognized expert in the standardization of autoimmune testing, and a co-author of the Italian GdS-AI SIPMeL guidelines (Gruppo di Studio in Autoimmunologia della Società Italiana di Patologia Clinica e Medicina di Laboratorio) on the diagnosis of autoimmune liver diseases.

The new Italian guidelines on autoimmune liver disease diagnostics represent an important step toward more practical approaches in this field. What were the main reasons for updating them, and what are the key differences compared to the EASL and IAHG recommendations?

Clinical Practice Guidelines by the International Autoimmune Hepatitis Group (IAHG) and by the European Association for the Study of the Liver (EASL) on the diagnosis and management of autoimmune hepatitis overlook diagnostic methods for autoantibody detection. These aspects tend to be neglected because they involve testing methodologies and technical protocols that are frequently outside the scope of general clinical practice and require specialized expertise.

The main differences are two: the substrate for the detection of anti-nuclear antibodies (ANA) and the starting dilution for indirect immunofluorescence methods for the detection of ANA, AMA, ASMA and anti-LKM antibodies. International guidelines have consistently recommended the use of triple rodent tissue (liver, kidney, and stomach) sections for detecting ANA in suspected AIH patients. However, already more than thirty years ago, the global standard in most immunology laboratories has shifted toward the use of HEp-2 cells as the default substrate for ANA detection.

The continued reliance on triple tissue slides in lieu of HEp-2 cells, according to recommendations, represents a notable gap between international group guidance and real-world laboratory practice.

Autoantibody profiling plays a key role in diagnosing AIH and PBC. Which markers do you currently find most clinically relevant?

In AIH, the most relevant markers are those included in the diagnostic criteria released by the IAHG: ANA, ASMA, LKM, and SLA. In PBC, AMA, anti-sp100 and anti-gp210.

A key point in your work is making the guidelines feasible for routine laboratories. Which technological or procedural advances could help achieve this goal?

No changes are necessary. Currently, all laboratories are equipped with analytical platforms perfectly capable of measuring all antibodies useful in the diagnosis of autoimmune liver diseases.

How do you see the role of multiparametric tests, such as line-blot panels, in complementing classical IIF and supporting AIH/PBC diagnosis?

Multiplex tests using dedicated antigen profiles are very useful in confirming the results obtained with screening tests in IIF. An AMA-like pattern on HEp-2 cells or an AMA, LKM or ASMA pattern on rodent tissue must always be confirmed with specific methods. In addition, do not forget that anti-SLA antibodies, which are one of the classification criteria for AIH, are not detectable in IIF and must therefore be searched for with blot or immunoenzymatic methods.

Your abstract discusses dilution thresholds. How critical are these cut-offs for ensuring inter-laboratory comparability and accurate interpretation?

This is the second aspect that differentiates our proposal from international recommendations. As dilution directly affects the diagnostic accuracy (ie, sensitivity and specificity) of the test, using the low cutoffs (1:20-1:40) recommended by international guidelines would expose to numerous false positives, especially in elderly patients or during transient infections. We believe that in clinical laboratories it is generally preferable to use a cutoff of 1:80 for both ANA and other antibodies, to ensure higher diagnostic specificity.

In your opinion, what are the most urgent priorities in the standardization of autoimmune liver disease diagnostics, and how can we bridge the gap between guidelines and everyday laboratory practice?

Standardization is a difficult, if not impossible, task given that there is no international standard for quantitative measurement of antibodies. Harmonization of methods would be a better and more feasible goal.

To be really effective, guidelines should be applicable to all clinical laboratories, not just the more experienced or reference ones, which probably constitute an insignificant portion of all clinical laboratories testing for antibodies in liver diseases. This may indeed lead to practical guidelines for antibody testing that can be adopted by all or most laboratories.

Thank you for the interview!

Interviewed by: Anna Kołtyś