W przypadku testu opartego na wykrywaniu RNA patogenu, RNA jest najpierw przekształcane w komplementarną nić DNA (cDNA) na drodze odwrotnej transkrypcji. W metodzie opartej na DNA, ten krok nie jest wymagany. Każdy zestaw testowy EURORealTime zawiera wszystkie gotowe do użycia odczynniki PCR, w tym odwrotną transkryptazę i/lub polimerazę DNA oraz specyficzne startery i sondy. W ten sposób liczba etapów pipetowania jest zredukowana do minimum: gotowe do użycia odczynniki PCR są po prostu pipetowane razem, a następnie dodaje się DNA/RNA.

Odpowiednie charakterystyczne sekwencje DNA/cDNA są wielokrotnie amplifikowane w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W tej reakcji dwa początkowe fragmenty DNA (startery) definiują region, który ma zostać powielany. Jeśli próbka pacjenta zawiera odpowiednią sekwencję DNA (sekwencję docelową), startery mogą się z nią związać i powstaje kopia sekwencji docelowej. Ta reakcja jest powtarzana, tak że region DNA między starterami jest kopiowany wykładniczo. Podczas każdego cyklu PCR specyficzne, znakowane fluorescencyjnie sondy DNA również wiążą się z sekwencją docelową. Powodują one sygnał fluorescencyjny tylko wtedy, gdy DNA zostało powielone. Pod koniec cyklu PCR mierzy się intensywność fluorescencji, aby można było śledzić amplifikację DNA w czasie rzeczywistym. Jeśli sekwencje docelowe nie są obecne w próbce pacjenta, startery i sondy nie mogą się z nimi związać, DNA nie jest amplifikowane, a sygnał fluorescencji nie wzrasta. Dzięki uwzględnieniu odpowiednich standardów do oznaczania ilościowego, metoda ta umożliwia również oznaczanie ilościowe DNA w oryginalnej próbce. Co więcej, różne sekwencje DNA można wykryć w jednej reakcji przy użyciu kilku barwników fluorescencyjnych o różnych długościach fal wzbudzenia i emisji.