Diagnostyka genetyczna zakażeń SARS-CoV-2 (PCR)

Zgodnie z zaleceniami Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) rozpoznanie infekcji SARS-CoV-2 wymaga potwierdzenia obecności materiału genetycznego wirusa w materiale pobranym od pacjenta (NAAT – nucleic acid amplification tests, w tym RT-PCR).

Zgodnie z zaleceniami WHO bezpośrednie wykrywanie patogenu za pomocą PCR jest jedyną zalecaną metodą określania ostrych zakażeń SARS-CoV-2.

Do zalet diagnostyki bezpośredniej opartej o metodę PCR zaliczamy:

• możliwość otrzymania wyników dodatnich przed wystąpieniem pierwszych objawów klinicznych
• możliwość otrzymania wyników dodatnich również u pacjentów, u których zakażenie przebiega bezobjawowo lub skąpo objawowo
• niskie ryzyko wystąpienia reakcji krzyżowych (przy odpowiednim doborze starterów)

Zalety testu EURORealTime SARS-CoV-2:

• kompatybilny ze standardowym wyposażeniem laboratorium genetycznego (termocyklery)
• łatwy do implementacji również w niewielkich laboratoriach
• tylko jedna reakcja na próbkę (niektóre inne testy wymagają kilku reakcji PCR na próbkę, przez co ocena jest bardziej złożona i rosną koszty badania)
• krótki czas badania – 80 min (PCR)
• wszystkie wymagane odczynniki są zawarte w zestawie i gotowe do użycia

EURORealTime SARS-CoV-2 – informacje podstawowe

Test EURORealTime SARS-CoV-2 oparty jest o reakcję odwrotnej transkrypcji, czyli proces przepisywania jednoniciowego RNA wirusa na dwuniciowy DNA. DNA jest w dalszej kolejności powielane w reakcji PCR i wykrywane w czasie rzeczywistym przy użyciu fluorescencyjnych znaczników dla zdefiniowanych obszarów genomu wirusa SARS-CoV-2.

• Tylko 1 reakcja na próbkę (odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja patogenu w jednej reakcji)
• Strategia podwójnego celu (równoległa detekcja 2 różnych sekwencji SARS-CoV-2 zapewniająca najwyższą czułość i specyficzność)
• Wysoka czułość badania:
  • detekcja wszystkich dotychczas opisanych wariantów wirusa SARS-CoV-2 (dane z 06.03.2020)
  • LOD = 0,5 cp/µl (limit of detection)
• Brak reaktywności krzyżowej (wstępne dane eksperymentalne potwierdzają brak reaktywności krzyżowej z innymi ludzkimi koronawirusami: 229E, OC43, NI63, SARS, MERS i innymi)
• Odczynniki gotowe do użycia – Master-Mix zawierający wszystkie niezbędne składniki (odwrotna transkryptaza, startery, sondy, nukleotydy, polimeraza)
• Wewnętrzna kontrola poprawności ekstrakcji RNA, odwrotnej transkrypcji i amplifikacji dla każdej próbki (zapobieganie wynikom fałszywie ujemnym)
• Kontrola pozytywna – kontrola zewnętrzna stosowana w każdej serii badań
• Walidacja na urządzeniach różnych producentów: LightCycler® 480 II (Roche), 7500 Fast Real-Time PCR Instrument (Applied Biosystems), CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)
• Czas reakcji: ok. 80 min
• Zestaw testowy na 100 reakcji

Strategia podwójnego celu

Wykrywanie nowego koronawirusa za pomocą testu EURORealTime SARS-CoV-2 opiera się na strategii podwójnego celu, w której w jednej reakcji amplifikowane są 2 regiony genetyczne: ORF1ab i N-Gen, co zapewnia najwyższą czułość i specyficzność badania oraz:

• skraca czas badania – wystarczy 1 reakcja na próbkę (testy oparte na RdRp ze względu na niższą czułość wymagają przeprowadzenia 3 reakcji na próbkę)
• zapobiega reakcjom krzyżowym (geny ORF1ab są wysokospecyficzne dla SARS-CoV-2)