ANA (przeciwciała przeciwjądrowe) stanowią najszerszą i często badaną grupę autoprzeciwciał. Są one skierowane przeciwko antygenom jądra komórkowego i cytoplazmy. Ich ocena jest kluczowym elementem diagnostyki chorób układowych tkanki łącznej. Badanie ANA stanowi kryterium rozpoznania wielu chorób, w tym tocznia układowego czy twardziny układowej. W niektórych przypadkach ich ocena umożliwia monitorowanie aktywności choroby i procesu terapeutycznego oraz prognozowanie wystąpienia choroby w przyszłości.

00:13 Czym są choroby autoimmunizacyjne?

01:50 Czym są przeciwciała przeciwjądrowe?

02:55 Jak wygląda strategia diagnostyczna ANA?

04:13 Jakie są metody badania przeciwciał przeciwjądrowych?

04:56 Czym są komórki HEp-2 i dlaczego stanowią złoty standard w diagnostyce ANA?

06:19 Jaka kombinacja substratów w immunofluorescencji pośredniej stanowi optymalne rozwiązanie do diagnostyki ANA?

07:00 Co powinno znaleźć się na wyniku badania przeciwciał ANA?

08:04 Jakie wyróżniamy typy fluorescencji?

08:57 W jakim celu oznaczamy miano ANA?

09:49 Czym jest efekt nakładania oraz efekt wysokiej dawki?

11:03 Z czego mogą wynikać problemy w diagnostyce ANA?

Czym są choroby autoimmunizacyjne?

Funkcją układu odpornościowego jest ochrona organizmu przed patogenami, w tym: bakteriami, wirusami, grzybami czy pierwotniakami. Odbywa się to m.in. poprzez produkcję przeciwciał – białek, które potrafią rozpoznać czynnik chorobotwórczy i go zniszczyć. Czasami jednak układ odpornościowy „myli się” i zwraca się przeciwko własnemu organizmowi. Dochodzi wówczas do produkcji przeciwciał, zwanych autoprzeciwciałami, które atakują własne (zdrowe) narządy i tkanki. Takie zaburzenia układu immunologicznego mogą prowadzić do rozwoju choroby autoimmunizacyjnej. Choroby autoimmunizacyjne stanowią szeroką grupę schorzeń i dotyczyć mogą każdej tkanki czy narządu. Wiele z tych chorób nazywanych jest chorobami układowymi tkanki łącznej albo „kolagenozami”. Należą do nich m.in.: reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty układowy, twardzina układowa, zespół Sjogrena czy zespół antyfosfolipidowy.

Czym są przeciwciała przeciwjądrowe?

Przeciwciała przeciwjądrowe (w skrócie ANA) stanowią najszerszą i często badaną grupę autoprzeciwciał. Zgodnie z definicją ANA to autoprzeciwciała skierowane przeciwko stałym i rozpuszczalnym antygenom jądra komórkowego i cytoplazmy. Ocena ANA jest kluczowym elementem diagnostyki chorób układowych tkanki łącznej. Badanie ANA stanowi kryterium rozpoznania wielu chorób, w tym tocznia układowego czy twardziny układowej. W niektórych przypadkach ich ocena umożliwia monitorowanie aktywności choroby i procesu terapeutycznego oraz prognozowanie wystąpienia choroby w przyszłości.

Jak wygląda strategia diagnostyczna ANA?

Oficjalne rekomendacje jednoznacznie zalecają dwuetapową diagnostykę przeciwciał ANA. Pierwszym etapem diagnostyki jest test przesiewowy oparty na metodzie immunofluorescencji pośredniej z wykorzystaniem komórek HEp-2. Wynikiem testu przesiewowego jest obraz mikroskopowy komórek wskazujący konkretny typ fluorescencji. Wynik ujemny IIFT jest ostateczny, podczas gdy wszystkie wyniki pozytywne należy potwierdzić drugą niezależną metodą. Drugi etap diagnostyki opiera się o testy monospecyficzne (typu ELISA czy immunoblot), w których oznacza się specyficzność antygenową badanych przeciwciał. W diagnostyce ANA bardzo ważne jest sprawdzenie, czy otrzymane wyniki ze sobą korelują. Mówiąc prościej, przed wydaniem wyniku ostatecznego należy sprawdzić, czy wynik testu monospecyficznego koreluje z odpowiednim wzorem fluorescencji uzyskanym na etapie badania IIFT.

Jakie są metody badania przeciwciał przeciwjądrowych?

Obecnie dostępnych jest wiele metod diagnostycznych służących do oceny przeciwciał przeciwjądrowych. Są one zróżnicowane pod względem czułości, swoistości, pozytywnej oraz negatywnej wartości predykcyjnej. Różnią się one również między sobą rodzajem stosowanych antygenów. Testy immunofluorescencji pośredniej oparte są o mieszaninę antygenów w postaci tkanki lub rozmazów komórkowych. W testach immunoenzymatycznych ELISA czy immunoblot stosuje się najczęściej oczyszczony i biochemicznie scharakteryzowany antygen natywny lub rekombinowany.

Czym są komórki HEp-2 i dlaczego stanowią złoty standard w diagnostyce ANA?

Komórki HEp-2 są komórkami nabłonkowymi ludzkiego raka krtani.

Komórki te stanowią idealny test przesiewowy do diagnostyki ANA, gdyż zawierają one bardzo szerokie spektrum antygenów do badania autoprzeciwciał. Szacuje się, że dzięki zastosowaniu komórek HEp-2 można wykryć aż do 150 potencjalnych autoprzeciwciał.

• Komórki HEp2 umożliwiają diagnozowanie autoprzeciwciał reagujących zarówno ze składnikami jądra komórkowego, jak i cytoplazmy
• Komórki te cechuje również wyższa specyficzność i czułość w porównaniu do wcześniej stosowanych tkanek zwierzęcych. Linia HEp-2 wywodzi się z ludzkich komórek, dlatego też lepiej nadaje się do detekcji ludzkich autoprzeciwciał
• Komórki te posiadają bardzo duże jądro komórkowe i duży rąbek cytoplazmy, co ułatwia ocenę wzrokową preparatu i pozwala na precyzyjne określenie typu fluorescencji
• Jako nowotworową linię komórkową cechuje je duża częstotliwość proliferacji, dzięki czemu możliwa jest ocena komórek w różnych stadiach cyku komórkowego, co pomaga w różnicowaniu typów świeceń.

Jaka kombinacja substratów w immunofluorescencji pośredniej stanowi optymalne rozwiązanie do diagnostyki ANA?

Immunofluorescencja pośrednia z zastosowaniem komórek HEp-2 stanowią złoty standard w diagnostyce ANA, ale idealnym rozwiązaniem do diagnostyki różnicowej są komórki HEp-2 z innymi substratami pomocniczymi, np. wątrobą małpy. Zastosowanie wątroby małpy jako substratu pomocniczego umożliwia niekiedy potwierdzenie określonego typu fluorescencji – wstępne różnicowanie typów fluorescencji – oraz może nam dostarczyć dodatkowych wyników.

Co powinno znaleźć się na wyniku badania przeciwciał ANA?

Na wyniku badania przeciwciał przeciwjądrowych powinny znaleźć się dwie podstawowe informacje: miano przeciwciał oraz typ fluorescencji.

Miano przeciwciał to najwyższe rozcieńczenie surowicy pacjenta, przy którym widoczny jest charakterystyczny typ fluorescencji. Oznaczanie miana przeciwciał ANA ma bardzo duże znaczenie diagnostyczne. Drugą informacją, jaka powinna znaleźć się na wyniku, jest typ fluorescencji. Mnogość antygenów jądrowych i cytoplazmatycznych powoduje, że związane z nimi przeciwciała generują różne typy fluorescencji, w zależności od morfologicznej lokalizacji antygenu. Przykładowo: jeśli antygen docelowy jest zlokalizowany jest w obrębie jąderek, to pod mikroskopem można zaobserwować fluorescencję jąderkową. Analogicznie – antygeny błony jądrowej będą determinować fluorescencję błonową.

Jakie wyróżniamy typy fluorescencji?

Zgodnie z najnowszymi rekomendacjami z roku 2015 możemy wyróżnić trzy podstawowe grupy świeceń: świecenia jądra komórkowego, świecenie cytoplazmatyczne oraz świecenie związane z elementami aparatu mitotycznego. Do najczęściej rozpoznawanych wzorów fluorescencji jądra komórkowego zaliczamy: świecenie homogenne, ziarniste, jąderkowe, punktowe (centromerowe lub nuclear dots) oraz świecenie błony jądrowej. Do fluorescencji cytoplazmatycznej zaliczamy świecenie ziarniste, drobnoziarniste oraz filamentowe. Za każdy typ świecenia odpowiedzialna jest inna grupa ANA, dlatego też informacja o wzorze fluorescencji zawęża pole do dalszych poszukiwań.

W jakim celu oznaczamy miano ANA?

Oznaczanie miano przeciwciał przeciwjądrowych ma duże znaczenie diagnostyczne.

Po pierwsze, miano autoprzeciwciał bardzo często koreluje z aktywnością choroby, służy zatem lekarzom do monitorowania skuteczności leczenia. Poza tym ANA w niskich mianach (np. 1:100) mogą występować również u ludzi zdrowych. W badaniu ANA poziom wykrywalności analitycznej leży poniżej poziomu wskazującego na patologiczny charakter oznaczanych przeciwciał. Jeżeli nie oznaczymy miana przeciwciał, osoba zdrowa może otrzymać wynik identyczny jak osoba chora.

Po drugie oznaczenie miana przeciwciał z wykorzystaniem szeregu rozcieńczeń surowicy pacjenta umożliwia uniknięcia błędów analitycznych.

Z czego mogą wynikać problemy w diagnostyce ANA?

Oznaczanie przeciwciał ANA jest niezwykle pomocne w postawieniu diagnozy. Pomimo istniejących rekomendacji diagnostyka ANA nadal wydaje się być problematyczna i interpretacja wyniku może wiązać się z kilkoma trudnościami. Problemy w diagnostyce ANA mogą wynikać z obecności tzw. naturalnych autoprzeciwciał oraz z innej prezentacji antygenów i jego dostępności dla autoprzeciwciał w testach wykonywanych różnymi metodami.

System odpornościowy większości z nas produkuje autoprzeciwciała, ale zwykle w niewielkiej ilości. Naturalne autoprzeciwciała to przeciwciała obecne w surowicy zdrowych ludzi, u których nie nastąpiła immunizacja jakimkolwiek antygenem. Natomiast patologiczne ludzkie autoprzeciwciała uznają prawidłowe, naturalnie występujące w naszym ciele białka lub inne składniki komórki za obce i niebezpieczne. W badaniu ANA poziom wykrywalności analitycznej leży poniżej poziomu wskazującego na patologiczny charakter oznaczanych przeciwciał. Dlatego też należy pamiętać, że przy badaniu przesiewowym ANA niezwykle istotne jest nie tylko wykrycie obecności przeciwciał, ale przede wszystkim określenie ich miana.