Wywiad z Profesorem dr. hab. n. med. Markiem Sanakiem – Kierownikiem Zakładu Diagnostyki Biochemicznej i Molekularnej Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie, Kierownikiem Zakładu Biologii Molekularnej i Genetyki Klinicznej II Katedry Chorób Wewnętrznych im. prof. Andrzeja Szczeklika Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie.

Panie Profesorze, czy może nam Pan opowiedzieć o najnowszych technologiach i metodach diagnostycznych w odniesieniu do genetyki, które zostały wprowadzone w Pańskim laboratorium w ciągu ostatnich lat? Jakie są główne zalety tych technologii w porównaniu ze starszymi metodami diagnostycznymi? Czy te nowe technologie umożliwiają dokładniejszą i szybszą diagnostykę chorób o podłożu genetycznym?

No cóż, jako lekarz i diagnosta w wieku prawie emerytalnym powiem, że zaczynałem od ręcznie wykonywanych badań genetycznych, w których DNA amplifikowało się techniką PCR i trawiło enzymem restrykcyjnym. Najważniejsze było umiejętne przygotowanie żelu agarozowego, na którym się analizowało fragmenty DNA świadczące o obecności wariantów genetycznych. Potem przez ponad dekadę używałem już zautomatyzowanej elektroforezy z fluorescencyjną detekcją fragmentów trawionego DNA po jego wyznakowaniu. Następne kilkanaście lat to była era PCR czasu rzeczywistego (real-time PCR). Warianty nukleotydowe wykrywało się za pomocą degradowalnych sond hybrydyzacyjnych. Wreszcie od ponad roku używamy do wykrywania obecności wariantów genetycznych, czyli genotypowania, mikromacierzy hybrydyzacyjnych. Ta ostatnia technika ma kilka zalet, z których najważniejszą jest jej certyfikacja do diagnostyki molekularnej (IVD), wymagana od roku 2022 w krajach Europy.

Co skłoniło Państwa do wyboru mikromacierzy w laboratorium?

Obok wspomnianej certyfikacji, bez której poprzednie techniki wymagały walidacji w laboratorium, ważną zaletą genotypowania na mikromacierzach jest możliwość badania w multipleksie. To jest wykrywanie wariantów kilku genów lub kilku wariantów tego samego genu jednocześnie. Ponadto optymalizacja reakcji PCR pozwala na badanie próbki bez uprzedniej ekstrakcji DNA. Samo wykrywanie sygnału fluorescencyjnego rozróżniającego warianty genetyczne jest zautomatyzowane. Wreszcie mikromacierze hybrydyzacyjne mają plamki kontrolne. W poprzednich technikach trzeba było samemu nałożyć wzorcowe próbki DNA jako kontrolę. Skaner mikromacierzy po zebraniu obrazu barwnego współpracuje z oprogramowaniem dokonującym dokumentacji i interpretacji wyniku. Jak przystało na nieufnego diagnostę, pierwszy miesiąc pracowaliśmy oboma metodami równolegle, potwierdzając zgodność wyników. Od 16 lat uczestniczymy w europejskiej kontroli jakości, w której mikromacierzowe genotypowanie również się sprawdziło. Nie ukrywam, że genotypowanie na podstawie PCR czasu rzeczywistego było tańsze, ale tylko jeśli się wykonywało badanie wielu próbek jednocześnie. Jest to coś podobnego do optymalizacji kosztów oznaczeń immunochemicznych techniką ELISA. Mikromacierze genotypujące (dodajmy, że małej gęstości) są konfigurowane przez producenta w taki sposób, że można najczęściej wykonywane genotypowania wariantów wykonać multipleksowo i nie trzeba odkładać badania do czasu uzbierania kilkudziesięciu próbek.

Jakie są najważniejsze zalety mikromacierzy w porównaniu z innymi metodami diagnostycznymi, takimi jak sekwencjonowanie Sangera czy metody real-time PCR?

Przy badaniach naukowych, również klinicznych, nadal sekwencjonuję fragmenty DNA techniką Sangera. Jest ona słusznie uznawana za wzorcową metodę genotypowania. Na chromatogramie widać nie tylko zmiany nukleotydowe, ale także warianty insercyjno-delecyjne. Niestety jest czasochłonna i jeśli rzadko używana, może sporo kosztować. W naszym instrumencie IVD odczynniki mają zapisane w czipach RF datę ważności i datę pierwszego użycia. Z czasem trzeba je wymienić na nowe, nawet jeśli pracowały jedynie raz. Podsumowując, metoda ta ma małą przepustowość, jest za to bardzo dokładna.

PCR czasu rzeczywistego z sondami degradowalnymi to świetna technika do analiz bardzo licznych próbek.

Mikromacierze hybrydyzacyjne lokują się między tymi metodami. Są przede wszystkim wygodne dla laboratorium o umiarkowanej przepustowości, rzędu do 200–300 próbek miesięcznie, jeśli w jego ofercie jest analiza kilkunastu genotypów.

Jakie korzyści daje użycie mikromacierzy w badaniach genetycznych w kontekście medycyny spersonalizowanej?

W tym przypadku zapotrzebowanie polskiego i ogólnie europejskiego systemu opieki zdrowotnej rozmija się z ofertą testów. Inaczej jest w USA. Zwłaszcza w onkologii coraz częściej przed rozpoczęciem planowanej chemioterapii sprawdza się ryzyko wystąpienia ciężkich reakcji niepożądanych. Tym zajmuje się farmakogenetyka, a dokładniej – farmakogenetyka farmakokinetyczna. Można wykryć u chorego warianty niedoborowe metylotransferazy tiopurynowej (TPMT) albo dehydrogenazy dihydropirymidynowej (DPD) i uniknąć ciężkich aplazji szpiku po pierwszym podaniu chemioterapeutyku. Można również wykryć warianty genetyczne wpływające na tempo N-acetylacji i wydalania z moczem leków neurologicznych i jeszcze kilku innych. Z tej grupy personalizowanych badań w naszym laboratorium najczęściej pojawiają się zlecenia zbadania dwóch pospolitych wariantów metylotransferazy tetrahydrofolianowej (MTHFR).

Dziękuję za rozmowę.

Dziękuję.

Rozmawiał: Wojciech Wróblewski

Autorką zdjęcia jest Karolina Fok-Jamróz, zdjęcie pochodzi z Archiwum SU.