Wywiad z prof. dr hab. n. med. Joanną Natorską, kierowniczką Pracowni Krakowskiego Centrum Badań i Technologii Medycznych Krakowskiego Szpitala Specjalistycznego im. św. Jana Pawła II

NEToza (ang. NETosis) to proces uwalniania przez neutrofile zewnątrzkomórkowych sieci (NETów), które stanowią ważny element odpowiedzi immunologicznej, choć w niektórych sytuacjach mogą sprzyjać rozwojowi chorób autoimmunizacyjnych i zapalnych. W jakich jednostkach chorobowych rola NETozy została najlepiej poznana i udokumentowana?

NEToza to wyspecjalizowany mechanizm obronny neutrofili, który wykracza poza klasyczne formy ich aktywacji, takie jak fagocytoza czy degranulacja. W odpowiedzi na silne bodźce zapalne neutrofile mogą uwalniać tzw. zewnątrzkomórkowe sieci neutrofilowe, określane jako NETsy. Są to trójwymiarowe struktury oparte na zdekondensowanej chromatynie, nasycone enzymami ziarnistości neutrofili, m.in. elastazą neutrofilową (NE), mieloperoksydazą (MPO) czy proteinazą 3 (PR3). Proces powstawania NETsów jest złożony i obejmuje aktywację oksydazy NADPH, modyfikacje histonów, takie jak cytrulinacja, a następnie stopniową dezintegrację struktur komórkowych prowadzącą do uwolnienia sieci DNA do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. W zależności od warunków immunologicznych NEToza może przebiegać w wariancie „suicydalnym”, prowadzącym do śmierci komórki, albo w formie „żywej”, w której neutrofil pozostaje funkcjonalny pomimo uwolnienia chromatyny. NETsy pełnią kluczową rolę w pierwszej linii odporności przeciwko patogenom. Dzięki swojej przestrzennej budowie działają jak lepka białkowa sieć unieruchamiająca drobnoustroje – zarówno bakterie i grzyby, jak i niektóre wirusy. Struktury te lokalnie koncentrują czynniki o silnych właściwościach bakteriobójczych, w tym enzymy proteolityczne, reaktywne formy tlenu czy cytotoksyczne histony. W efekcie NETsy nie tylko zatrzymują patogeny w miejscu infekcji, ale także ułatwiają ich neutralizację w środowisku, w którym stężenie czynników przeciwdrobnoustrojowych jest znacznie wyższe niż we wnętrzu pojedynczej komórki. Ta strategia ma szczególne znaczenie w warunkach dużego obciążenia drobnoustrojami lub w sytuacjach, gdy patogeny są oporne na fagocytozę. Coraz lepiej rozumiemy również rolę NETozy w procesie immunozakrzepicy (immunotrombozy), który można traktować jako pomost pomiędzy układem odpornościowym a układem krzepnięcia. NETsy pełnią funkcję rusztowania dla tworzącej się skrzepliny: bezpośrednio wiążą aktywowane płytki krwi, aktywują czynnik XII i stabilizują włókna fibryny, dzięki czemu skrzeplina staje się bardziej zwarta i odporna na fibrynolizę. Jednocześnie komponenty NETsów, zwłaszcza histony, mogą uszkadzać śródbłonek, co dodatkowo wzmacnia sygnalizację prozakrzepową poprzez ekspresję czynnika tkankowego (TF). W warunkach fizjologicznych immunotromboza pełni funkcję ochronną – pomaga „uwięzić” patogeny w mikrozakrzepie i tym samym ograniczyć ich rozprzestrzenianie w organizmie. Jednak w sytuacjach nadmiernej lub niekontrolowanej NETozy mechanizm ten staje się patogenny i przyczynia się do powstawania zakrzepów. Taką sytuację obserwuje się m.in. w sepsie, zespołach autoimmunologicznych czy w ciężkim przebiegu COVID-19. W efekcie NEToza jawi się dziś jako proces o dwóch obliczach: z jednej strony stanowi efektywną metodę eliminacji patogenów, z drugiej – w określonych warunkach może napędzać stan zapalny i zaburzenia krzepnięcia. Zrozumienie tego złożonego balansu jest jednym z kluczowych wyzwań współczesnej immunologii. Rola NETozy została najlepiej poznana w chorobach autoimmunizacyjnych i autozapalnych, takich jak toczeń rumieniowaty układowy (SLE), reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) czy zapalenia naczyń ANCA-zależne (AAV). W chorobach tych białka NETsów, głównie DNA i histony, stają się celem autoprzeciwciał, a zaburzenia degradacji tych białek, spowodowane blokowaniem DNaz przez autoprzeciwciała, sprzyjają powstawaniu kompleksów immunologicznych i zaostrzeniom choroby. Ponadto NETsy dostarczają cytrulinowanych białek, które są źródłem autoantygenów dla przeciwciał anty-CCP, a także wzmacniają aktywację TLR9 i INF-α, napędzając błędne koło odpowiedzi autoimmunizacyjnej. Jak wspomniano, NETsy są bogate w MPO i PR3, co ułatwia prezentację antygenów dla przeciwciał ANCA oraz uszkodzenie śródbłonka i inicjację martwiczego zapalenia naczyń.

Drugą grupę chorób stanowią choroby infekcyjne i sepsa. Choć NETsy pełnią funkcję obronną, w infekcjach bakteryjnych i grzybiczych (E. coli, S. aureus, Candida) ich nadmierna produkcja, np. w sepsie, powoduje uszkodzenie tkanek wynikające głównie z cytotoksyczności dodatnio naładowanych histonów, powodującej niewydolność wielonarządową i zaburzenia mikrokrążenia. Nadmierna NEToza prowadzi też do „nadaktywacji” makrofagów i burzy cytokinowej. Badania wykazały, że blokowanie procesu NETozy poprawia przeżywalność w modelach sepsy.

Kolejną grupą chorób, w których rola NETs została opisana, są choroby zakrzepowo-zatorowe. NETsy działają jak rusztowanie do tworzenia skrzeplin, wiążąc płytki i czynniki krzepnięcia, co prowadzi do omówionej wcześniej immunotrombozy. Ponadto histony nasilają stan prozakrzepowy, aktywując kaskadę krzepnięcia poprzez aktywację czynnika XII, a także uszkadzają śródbłonek naczyń krwionośnych. Obecność NETs stwierdzono m.in. w świeżych skrzeplinach, przy czym ich ilość korelowała z ciężkością zakrzepicy, oraz w mikroskrzeplinach, których powstawanie przyczynia się do niewydolności narządowej, np. w COVID-19.

Patofizjologiczną rolę NETs opisano także w łuszczycy, w której uwalniają one LL-37 (peptyd przeciwdrobnoustrojowy), wiążący DNA i tworzący kompleksy aktywujące komórki dendrytyczne i populację Th17, co napędza produkcję kluczowych w przebiegu łuszczycy cytokin IL-17 i IL-23.

Podwyższone stężenie białek związanych z NETozą obserwowano również w cukrzycy typu 2 i typu 1, gdzie prawdopodobnie należą do mediatorów przewlekłego stanu zapalnego, dysfunkcji śródbłonka i powikłań naczyniowych, gdyż hiperglikemia i stres oksydacyjny wzmagają NETozę. U pacjentów z cukrzycą nasilona NEToza koreluje z podwyższonymi stężeniami IL-6, CRP i opornością na insulinę.

Nasiloną NETozę obserwuje się także w chorobach nowotworowych (m.in. w raku piersi, trzustki czy jelita grubego), w których NETsy prawdopodobnie uczestniczą w procesach przerzutowania i mikrozakrzepicy nowotworowej, chronią komórki nowotworowe przed limfocytami cytotoksycznymi oraz wspierają ich adhezję i migrację.

W jednej z ostatnich publikacji Pani Profesor analizowano rolę markerów NETozy w chorobach sercowo-naczyniowych. Jakie najważniejsze wnioski płyną z tych badań i czy mogą one w przyszłości znaleźć zastosowanie w praktyce klinicznej?

Tak, nasze badania, a także badania innych zespołów, wskazują na zaangażowanie NETsów w patogenezę chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Rosnąca liczba dowodów łączy formowanie NETsów z rozwojem miażdżycy, gdzie prawdopodobnie uczestniczą one w destabilizacji blaszek miażdżycowych, tworzeniu skrzeplin oraz progresji choroby. W naszch badaniach z udziałem pacjentów z zaawansowaną chorobą wieńcową wykazaliśmy, że intensywna terapia statynami (wysokie dawki atorwastatyny lub rosuwastatyny), niezależnie od redukcji poziomu LDL, istotnie obniża poziomy trzech białek związanych z NETsami, tj. citH3, MPO i NE. Zatem obserwacja ta wydaje się mieć duży potencjał kliniczny, polegający na obserwacji, że statyny mogą wywierać dodatkowe działanie przeciwzapalne i antyzakrzepowe poprzez modulację NETozy, co może częściowo tłumaczyć ich korzystny wpływ na redukcję incydentów sercowo-naczyniowych u pacjentów wysokiego ryzyka. Jeśli kolejne badania potwierdzą te zależności, pomiar stężenia białek związanych z NETozą mógłby służyć nie tylko do oceny ryzyka, ale również jako wskaźnik skuteczności terapii statynami.

Ponadto obserwowaliśmy udział NETsów w ostrym zawale serca, niewydolności serca czy udarze niedokrwiennym mózgu. W chorobach tych spadek nasilenia NETozy korelował z poprawą wybranych właściwości układu krzepnięcia i fibrynolizy, m.in. zwiększoną przepuszczalnością skrzepu (luźniejsza sieć fibrynowa) i obniżoną aktywnością inhibitora fibrynolizy (TAFI), co sugeruje, że hamowanie NETozy może przekładać się na obniżenie prozakrzepowego potencjału krwi. Nasze badania wskazują, że NETsy to „nowy gracz” w terapii chorób sercowo‑naczyniowych – obok klasycznych interwencji przeciwpłytkowych, przeciwzapalnych czy profibrynolitycznych. Badania te identyfikują także kilka obiecujących kierunków badań klinicznych. Po pierwsze profilaktyka i leczenie chorób układu krążenia z uwzględnieniem inhibicji tworzenia NETsów. Jeżeli dalsze badania potwierdzą, że obniżenie aktywności NETozy (np. przez statyny, leki przeciwzapalne, leki modyfikujące fibrynolizę, a w przyszłości może środki bezpośrednio oddziałujące na NETsy) przekłada się na redukcję incydentów zakrzepowo-zatorowych czy progresji miażdżycy, to NETsy mogą stać się realnym celem terapeutycznym. Po drugie NETsy mogą stanowić nowe markery prognostyczne u pacjentów z CVD. Białka związane z NETs (szczególnie citH3 i MPO‑DNA) mogą posłużyć do lepszej stratyfikacji ryzyka oraz identyfikowania chorych zagrożonych zakrzepicą i destabilizacją blaszki, co mogłoby wspierać decyzje o intensyfikacji leczenia. Po trzecie zrozumienie roli NETozy mogłoby pomóc w doborze terapii bardziej ukierunkowanych na degradację NETów.

Należy jednak wyraźnie zaznaczyć, że każde z tych badań ma swoje ograniczenia, które stoją na przeszkodzie szybkiej translacji badań naukowych do praktyki klinicznej. Po pierwsze markery NETsów nie są specyficzne ani wystandaryzowane. Sam poziom citH3, MPO czy NE we krwi może być modulowany przez wiele czynników, a nie wszystkie kompleksy lub fragmenty białek czy histonów muszą pochodzić z NETsów. Po drugie nie ma dużych prospektywnych badań klinicznych. Większość obserwacji pochodzi z badań pilotażowych, przekrojowych lub obserwacyjnych. Potrzeba randomizowanych, kontrolowanych badań, by udowodnić, że modulacja NETozy ma realny wpływ na występowanie zdarzeń sercowo-naczyniowych. I po trzecie heterogeniczność chorób i pacjentów utrudnia stworzenie uniwersalnych rekomendacji, np. CVD to grupa bardzo zróżnicowanych schorzeń; rola NETozy najprawdopodobniej będzie różna w zależności od typu CVD, stadium, czy współistniejących czynników ryzyka. Pełna implementacja tej wiedzy do praktyki klinicznej, czyli wykonywanie testów oceniających nasilenie procesu NETozy w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej oraz stosowanie leków celujących w proces NETozy, wymaga kilku kolejnych faz badań: standaryzacji metod, dużych badań klinicznych oraz oceny skuteczności i bezpieczeństwa zaproponowanych leków.

W ostatnich latach obserwujemy rosnące zainteresowanie NETozą jako potencjalnym celem zarówno diagnostycznym, jak i terapeutycznym. Czy obecnie dostępne są już metody oznaczania NETs w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej?

Według mojej najlepszej wiedzy obecnie nie istnieje powszechnie stosowana, zatwierdzona diagnostycznie (IVD) i wystandaryzowana metoda oznaczania NETów w rutynowej diagnostyce, a dostępne zestawy i protokoły mają istotne ograniczenia analityczne i przedanalityczne, które uniemożliwiają ich rutynowe wdrożenie.

Teoretycznie najbardziej swoistym i sensownym markerem NETsów we krwi krążącej są kompleksy białko neutrofilowe–DNA (np. MPO–DNA), ponieważ stanowią one połączenie komponentu typowego dla ziarnistości neutrofili, czyli mieloperoksydazy, z chromatyną – „składnikiem charakterystycznym” NETsów a nie tylko jedną z wielu składowych (np. samo DNA czy samo MPO), które mogą pochodzić z różnych źródeł. Takie kompleksy były używane w licznych badaniach obserwacyjnych i korelowały z ciężkością sepsy czy przebiegiem COVID-19. Dlaczego mimo to nie mamy rutynowego testu MPO–DNA? Istnieje kilka głównych powodów. Po pierwsze problemy ze specyficznością i interpretacją w próbkach osocza lub surowicy. Standardowe protokoły ELISA do wykrywania MPO–DNA dają dobre, zależne od dawki sygnały w modelach in vitro, ale w próbkach pacjentów, szczególnie w osoczu, ich specyficzność bywa wątpliwa i wyniki nie zawsze korelują z innymi białkami związanymi z NETozą. Po drugie silna zależność stężenia MPO–DNA od warunków przedanalitycznych, tzn. pomiar kompleksów jest wrażliwy na rodzaj próbki (osocze kontra surowica), użyty antykoagulant, czas od pobrania do odwirowania, temperaturę i liczbę cykli rozmrażania. Po trzecie zaś brakuje wystandaryzowanych kalibratorów i materiałów referencyjnych. Dla rutynowego testu diagnostycznego potrzebny jest znormalizowany kalibrator, kontrola jakości międzylaboratoryjnej i ustalone wartości referencyjne. W badaniach NETsów każdy zespół stosuje własne standardy (np. NETsy generowane in vitro), co utrudnia porównywalność i walidację. Czwartym powodem jest duża interferencja i nieswoistość sygnału. W osoczu występują wolne DNA z różnych źródeł (apoptoza, nekroza), immunoglobuliny, dopełniacz i białka o podobnych epitopach. To wszystko może dawać fałszywe sygnały lub zakłócać pomiar.

Dlatego w większości przypadków w badaniach nad NETozą stosujemy pomiar stężenia citH3. Jednak nie jest to specyficzny, unikatowy marker NETozy. Cytrulinacja histonów zachodzi także w innych procesach zapalnych (np. w niektórych formach martwicy czy w chorobach autoimmunologicznych, dla których charakterystyczna jest nadmierna cytrulinacja), co ogranicza specyficzność citH3 jako markera NETsów. Dodatkowo wolne cytrulinowane histony mogą pochodzić z komórek, które zginęły w wyniku innych mechanizmów niż NEToza. W praktyce oznaczenia citH3 dają użyteczne informacje, ale interpretacja wymaga kontekstu klinicznego i porównania z innymi markerami. Najsensowniej interpretować profile wielomarkerowe (np. MPO/NE + DNA + citH3 + parametry krzepnięcia) oraz dane kliniczne, zamiast polegać na jednym pomiarze. Badania pokazują, że kombinacje markerów lepiej korelują ze stopniem nasilenia NETozy i stanem klinicznym niż pojedyncze testy.

Jak zdaniem Pani Profesor kształtuje się przyszłość badań nad NETozą w Polsce i na świecie? Czy możemy spodziewać się szybkiego przełożenia wyników badań podstawowych na praktykę kliniczną?

Przyszłość badań nad NETozą, zarówno w Polsce, jak i na świecie, rysuje się niezwykle dynamicznie, ale jednocześnie wymaga dużej ostrożności w ocenie tempa realnych postępów klinicznych. Obecnie obserwujemy intensywny rozwój kilku równoległych nurtów badawczych: standaryzacji pomiarów NETsów, zrozumienia mechanizmów molekularnych NETozy, testowania strategii terapeutycznych ukierunkowanych na NETsy oraz ich degradowanie. Na świecie widać wyraźny wzrost nakładów na projekty dotyczące standaryzacji markerów NETsów, opracowania inhibitorów PAD4, enzymu kluczowego dla cytrulinacji histonów, enzymatycznej lub immunologicznej degradacji NETów (np. DNazy, przeciwciała antyhistonowe) czy mapowania heterogenności NETozy, ponieważ coraz bardziej jasne staje się, że nie istnieje jeden uniwersalny typ NETozy, a proces ten może być zależny od bodźca, kontekstu tkankowego i stopnia aktywacji neutrofili.

Duże międzynarodowe konsorcja już dziś pracują nad ujednoliceniem metod, które pozwoliłyby porównywać wyniki między ośrodkami, co jest kluczowe, zanim zaczniemy myśleć o wdrożeniu markerów NETsów do rutynowej diagnostyki.

W Polsce w ostatnich latach widać rosnącą aktywność naukową w tym obszarze, szczególnie w wieloośrodkowych projektach dotyczących sepsy, chorób autoimmunizacyjnych, powikłań zakrzepowych czy immunotrombozy w COVID-19. Polskie zespoły badawcze coraz częściej uczestniczą w międzynarodowych inicjatywach, a dostęp do technologii obrazowania i analiz wieloparametrowych (omicznych, cytometrii, mikroskopii wysokiej rozdzielczości) ulega systematycznej poprawie. Czy możemy spodziewać się szybkiego przełożenia wyników badań podstawowych na praktykę kliniczną? Krótko mówiąc, postęp jest obiecujący, ale translacja będzie stopniowa i raczej ewolucyjna niż rewolucyjna. Najważniejsze bariery to brak standaryzowanych, specyficznych testów do pomiaru NETsów, co utrudnia wypracowanie jednego uniwersalnego wskaźnika. Dlatego w najbliższych latach bardziej realne wydaje się opracowanie testów badających nasilenie powstawania NETs umożliwiających prowadzenie badań klinicznych, a dopiero w dalszej perspektywie – leków ukierunkowanych na regulację NETozy.

Podsumowując, badania nad NETozą znajdują się dziś w fazie intensywnego rozwoju i rosnącej dojrzałości metodologicznej. Ich potencjał kliniczny jest bardzo duży, zwłaszcza w obszarze chorób zapalnych i zakrzepowych, ale przejście od badań podstawowych do rutynowej praktyki klinicznej wymaga jeszcze standaryzacji, walidacji i oceny bezpieczeństwa. Można więc powiedzieć, że jesteśmy już na dobrej drodze, ale najważniejsze etapy translacji dopiero przed nami.

W jakich grupach pacjentów warto rozważyć badania w kierunku NETozy? Czy istnieją konkretne wskazania kliniczne lub parametry laboratoryjne, które mogą sugerować konieczność poszerzenia diagnostyki w tym kierunku?

Są takie grupy pacjentów oraz sytuacje kliniczno-laboratoryjne, w których badanie stężenia białek związanych z NETozą może być szczególnie uzasadnione w kontekście badań naukowych lub rozszerzonej diagnostyki specjalistycznej. Dotyczy to zwłaszcza chorób, w których rola NETsów jest dobrze udokumentowana i wiąże się z patogenezą powikłań zakrzepowych lub z uszkodzeniem tkanek, czyli jednostek chorobowych omówionych w pierwszym pytaniu. Tak więc powtórzmy: do chorób tych należą choroby przebiegające z wysokim ryzykiem zakrzepicy, w których NETsy są uznawane za jeden z mediatorów patologicznej aktywacji krzepnięcia. Zaliczymy do tej grupy sepsę, ciężki przebieg COVID-19, zespół rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC), zespół antyfosfolipidowy (APS), zapalenia naczyń, zwłaszcza ANCA-zależne, zakrzepice o nietypowej lokalizacji oraz niewyjaśnione epizody zakrzepowe u osób młodych. Druga grupa to choroby autoimmunizacyjne i autozapalne, czyli toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów – w związku z cytrulinacją białek, młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów, miopatie zapalne. Przypomnijmy, że w chorobach tych NETsy są źródłem autoantygenów i „promotorów” zapalenia, zatem pełnią dużą rolę w podtrzymywaniu autoimmunizacji. I ostatnia grupa to ciężkie lub przewlekłe zakażenia bakteryjne (np. Staphylococcus aureus), w których nadmierna NEToza może prowadzić do immunotrombozy lub uszkodzenia narządów.

Aktualnie nie ma zdefiniowanych wskazań klinicznych czy laboratoryjnych sugerujących konieczność wykonania u pacjenta badań w kierunku nadmiernej NETozy. Pewne wzorce mogą jednak skłaniać do rozszerzenia diagnostyki, np. niewyjaśnione lub nawracające epizody zakrzepicy, zwłaszcza u młodych pacjentów, objawy mikroangiopatii zakrzepowej, nagłe pogorszenie funkcji narządów w przebiegu chorób zapalnych, brak odpowiedzi na standardową antykoagulację. Natomiast spośród parametrów laboratoryjnych jako wskaźniki nasilonej NETozy można rozważyć podwyższony stosunek neutrofile/limfocyty (NLR), podwyższone D-dimery, fibrynogen, bez jednoznacznej przyczyny, wysokie stężenie CRP, IL-6, przy jednoczesnej nasilonej aktywacji układu krzepnięcia, czy obecność cech aktywowanego śródbłonka, np. wysokie stężenie czynnika von Willebranda.

Jednak z uwagi na brak wystandaryzowanych testów i brak markerów o wysokiej specyficzności pomiar NETsów powinien być traktowany wyłącznie jako narzędzie pomocnicze, stosowane w wybranych sytuacjach klinicznych jako element rozszerzonej diagnostyki specjalistycznej, a nie jako część rutynowej praktyki laboratoryjnej. Dopiero opracowanie wystandaryzowanych, swoistych testów pozwoliłoby rozważyć szersze zastosowanie kliniczne.

Dziękuję za rozmowę.

Rozmawiał: Paweł Krzemień