Przeciwciała przeciwjądrowe (ang. antinuclear antibodies, ANA) są biomarkerami wielu chorób autoimmunizacyjnych. Ich wykrywanie jest często kluczowym etapem w procesie stawiania rozpoznania, a testy, które umożliwiają ich detekcję, są istotnym narzędziem w diagnostyce wielu schorzeń, w tym przede wszystkim układowych chorób tkanki łącznej, ale także autoimmunologicznego zapalenia wątroby oraz pierwotnego stwardniającego zapalenia dróg żółciowych.
Najczęściej stosowaną metodą detekcji ANA jest immunofluorescencja pośrednia na komórkach HEp-2 (ang. HEp-2 indirect immunofluorescence assay, HEp-2 IFA). Wyniki HEp-2 IFA mogą być jednak zależne od różnorodnych czynników, takich jak subiektywna interpretacja wyników (obrazu mikroskopowego), czy aspektów technicznych, np. rozcieńczenia surowicy, rodzaju substratu oraz koniugatu. W ostatnich latach niektóre laboratoria zaczęły wdrażać nowoczesne metody oznaczania ANA, w tym zautomatyzowane systemy diagnostyki wspomaganej komputerowo (ang. computer-assisted diagnosis, CAD) oraz testy fazy stałej (ang. solid phase assays, SPA), które niosą z sobą nowe możliwości, ale równocześnie wiążą się z coraz większą potrzebą standaryzacji badań ANA.
W związku z dynamicznym rozwojem technologicznym oraz potrzebą poprawy standaryzacji badań ANA Europejska Federacja Chemii Klinicznej i Medycyny Laboratoryjnej (ang. European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, EFLM), Europejska Inicjatywa Standaryzacji Autoimmunologii (ang. European Autoimmunity Standardization Initiative, EASI) i Międzynarodowy Konsensus w sprawie Typów Świeceń ANA (ang. International Consensus on ANA Patterns, ICAP) opracowały nowe rekomendacje. Mają one na celu nie tylko ujednolicenie metod diagnostycznych, ale również wprowadzenie bardziej precyzyjnych kryteriów interpretacji wyników, co pozwala na trafniejsze rozpoznawanie i różnicowanie chorób autoimmunizacyjnych.
Ze względu na obszerny zakres nowych rekomendacji oraz szczegółowy opis każdego aspektu badania ANA, przygotowaliśmy dwa artykuły, które w przystępny sposób podsumowują najważniejsze informacje. W tym wpisie przedstawiamy kluczowe zmiany i zalecenia dotyczące wykrywania ANA. Drugi skupia się na klinicznych stanach związanych z ANA, omówionych zgodnie z aktualną wiedzą medyczną.
Wkład EUROIMMUN Polska w podnoszenie standardów diagnostyki ANA
Jako wiodący producent wysokiej jakości testów do detekcji autoprzeciwciał, w tym ANA, firma EUROIMMUN Polska aktywnie zaangażowała się w projekt tłumaczenia nowych rekomendacji. Nasze doświadczenie, specjalistyczna wiedza oraz współpraca z ekspertami pozwoliły nam na czynne uczestnictwo w tłumaczeniu rekomendacji na język polski. Jesteśmy dumni, że swoim działaniem możemy wspierać standaryzację i podnoszenie jakości diagnostyki ANA na polskim rynku. |
Nowe zalecenia wykrywania ANA z 2024 roku
Eksperci z wielu krajów zrzeszeni w organizacjach EFLM, EASI oraz ICAP sformułowali łącznie 35 rekomendacji/wytycznych dotyczących:
- badania i wydawania wyników badań w kierunku ANA za pomocą HEp-2 IFA;
- aspektów metodologicznych HEp-2 IFA, w tym wyboru substratu/koniugatu i zastosowania systemów CAD;
- kontroli jakości;
- sposobów walidacji HEp-2 IFA oraz SPA.
Opracowane rekomendacje i stanowiska zostały podzielone na dwie kategorie:
- pierwsza kategoria skupia się na różnych aspektach metodologicznych analizy ANA, z naciskiem na HEp-2 IFA;
- druga kategoria dotyczy zagadnień związanych z walidacją i weryfikacją IFA, obejmując zarówno walidację analityczną, jak i kliniczną.
Rekomendacje dotyczące metodologii analizy ANA
Nowe rekomendacje szczegółowo omawiają różnorodne aspekty metodologiczne analizy ANA, z naciskiem na technikę HEp-2 IFA, która od lat pozostaje złotym standardem w diagnostyce ANA. Nowe rekomendacje w tym zakresie obejmują 30 następujących zaleceń:
- ANA w HEp-2 IFA: ANA wykryte przy użyciu HEp-2 IFA powinny być raportowane wraz z oznaczeniem miana przeciwciał oraz wzoru świecenia ANA (1).
- Zakres referencyjny i znaczenie miana: Dla wielu wzorów świeceń wraz ze wzrostem miana przeciwciał rośnie prawdopodobieństwo wystąpienia AARD (ang. ANA-associated rheumatic disease) (2). Ustalono, że dla większości wzorów nie ma jednego optymalnego punktu odcięcia w HEp-2 IFA, który jest związany zarówno z optymalną czułością, jak i swoistością dla AARD (3). Uwzględnienie poziomu przeciwciał pomaga zinterpretować wyniki testu ANA (4). W związku z tym podawanie wskaźników wiarygodności (LR, ang. likelihood ratio) specyficznych dla miana lub wyniku zwiększa trafność klinicznej interpretacji wyników testu HEp-2 IFA w kierunku AARD (5).
- ANA u osób zdrowych: ANA mogą występować u znacznej liczby zdrowych osób (w tym dzieci, dorosłych i osób starszych), a częstość ich występowania wzrasta wraz z wiekiem. Fakt ten należy uwzględnić przy interpretacji wyników testów (6).
- ANA w układowych chorobach reumatycznych u dzieci: Nie ma dowodów na to, że w przypadku dzieci należy stosować niższe początkowe rozcieńczenie próbki w badaniu HEp-2 IFA w celu przesiewowego wykrywania AARD (7).
- Wzory świeceń: Wzór HEp-2 IFA może dostarczyć przydatnych informacji dotyczących znaczenia klinicznego i wskazówek do dalszych badań (8). Kliniczna istotność wyniku testu HEp-2 IFA zależy od obserwowanego wzoru świecenia (9). Korelacja wzoru świecenia HEp-2 IFA z wynikami testów antygenowoswoistych zwiększa znaczenie obu wyników (10).
Główne wzory ANA (o największym znaczeniu klinicznym) obejmują:
Jądrowy: centromerowy (AC-3), homogenny (AC-1), gęsty drobnoziarnisty (AC-2), ziarnisty (AC-4, 5), jąderkowy (AC-8, 9, 10), multiple nuclear dots (AC-6), błona jądrowa (AC-11, 12).
Cytoplazmatyczny: siateczkowaty/podobny do AMA (AC-21), (gęsty) drobnoziarnisty (AC-19, 20), liniowy aktynowy (AC-15) (11).
- Wybór substratu i koniugatu: Zgodnie z nowymi wytycznymi, jako substraty do przesiewowego badania ANA w IFA mogą być używane HEp-2, HEp-2000 i HEp-20-10 (12). Ponadto, użycie koniugatu specyficznego dla IgG jest wystarczające do wykrycia większości istotnych klinicznie ANA (13). Do zmienności wyników badania przyczynia się specyficzność izotypowa stosowanego koniugatu (poliwalentny/specyficzny dla IgG) (14).
- Mikroskopia automatyczna: System komputerowego wspomagania diagnozy (CAD) może wspierać testowanie HEp-2 IFA, zalecane jest jednak przeprowadzanie rewizji klasyfikacji wyników pozytywnych/negatywnych przez ekspertów (15). CAD może wspierać HEp-2 IFA, ale wymagane jest sprawdzenie oceny rozpoznanych wzorów przez ekspertów (16). Kilka spośród dostępnych systemów CAD dla HEp-2 IFA dostarcza informacji o intensywności fluorescencji (FI); pomiar FI zawiera: informacje o oszacowanym mianie, informacje na temat prawdopodobieństwa AARD (17). Śledzenie FI może przyczynić się do monitorowania jakości badania, np. jako część programu wewnętrznej kontroli jakości (ang. internal quality control, IQC) (nie dotyczy to wszystkich systemów na rynku) (18).
System EUROPAttern firmy EUROIMMUN to najwyższej klasy rozwiązanie, które zapewnia wiarygodne, w pełni automatyczne, rozpoznawanie wzorów HEp-2 IFA oraz określanie miana przeciwciał. |
- Sposoby zapewnienia jakości w badaniach HEp-2 IFA: Wykonanie testu HEp-2 IFA powinno być monitorowane poprzez wewnętrzne kontrole jakości (IQC), a także zewnętrzne programy kontroli jakości (19). Czynniki minimalizujące zmienność odczytów wyników przez różnych „obserwatorów” testu HEp-2 IFA to: programy edukacyjne, podwójna ocena, stosowanie nomenklatury ICAP oraz odczytywanie obrazów cyfrowych z monitora CAD (20). W każdej badanej serii powinny być uwzględnione co najmniej 2 próbki IQC (jedna negatywna i jedna słabo pozytywna [z poziomem docelowym odpowiadającym LR (ang. likelihood ratio) wynoszącym 2–5 dla AARD]), które są oceniane półilościowo (za pomocą m.in. ustalania miana końcowego lub automatycznego pomiaru intensywności fluorescencji) (21). Dodatkowo, oprócz kontroli zawartych w zestawach testowych, zaleca się stosowanie w celach kontrolnych próbek IQC uzyskanych od pacjentów, które traktuje się jak rutynowe próbki (umożliwiają one monitorowanie całej procedury badawczej). Próbki te mogą pochodzić od pojedynczych osób lub być uprzednio pulowane (22). Preferowany wzór świecenia dla próbki kontrolnej pozytywnej cechuje się wysoką odtwarzalnością (np. izolowany wzór homogenny lub ziarnisty w systemach CAD) (23). Pozostałe szczegółowe zalecenia dotyczące kontroli jakości zostały opisane pod numerami: 24–25.
- Monitorowanie serii odczynników w obrębie LOT i pomiędzy partiami LOT: Zmienność międzyseryjna dla koniugatów i/lub substratów powinna być oceniona przed wprowadzeniem nowej serii. Można to przeprowadzić przy użyciu próbek IQC pochodzących od pacjentów, uzupełnionych o próbki wybrane w celu minimalnego pokrycia różnych kompartmentów komórkowych (jądra i cytoplazmy) oraz różnych wielkości miana (26).
- ANA w testach typu SPA: Przydatność kliniczna SPA w celu przesiewu/diagnozy AARD zależy od jednostki chorobowej i rodzaju testu (27). Nie ma jednego progu SPA, który zapewniłby optymalną czułość i swoistość dla testów w kierunku AARD (28). Podawanie specyficznych wskaźników LR na wynikach testów SPA w kierunku AARD może ułatwiać kliniczną interpretację tych wyników (29). Kombinacja HEp-2 IFA z testami SPA w celu skriningu AARD zwiększa wartość kliniczną (30).
Rekomendacje w zakresie walidacji i weryfikacja IFA
Druga kategoria rekomendacji dotyczy aspektów walidacji i weryfikacji techniki IFA, zarówno pod kątem analitycznym, jak i klinicznym. Kluczowe punkty obejmują 5 zaleceń/wytycznych, które zostały szczegółowo omówione przez ekspertów (31–35).
Podsumowanie
Eksperci zalecają, aby badania przesiewowe w kierunku ANA były przeprowadzane u pacjentów z podejrzeniem chorób autoimmunizacyjnych. Przeciwciała przeciwjądrowe są kluczowymi biomarkerami w diagnostyce chorób autoimmunizacyjnych, takich jak m.in. układowe choroby tkanki łącznej. Rekomendacje podkreślają, aby wyniki testów ANA HEp-2 były przedstawiane z oznaczeniem miana przeciwciał oraz wzoru świecenia. Co istotne, wykonanie testu HEp-2 IFA powinno być monitorowane zarówno poprzez wewnętrzne, jak i zewnętrzne kontrole jakości. Systemy komputerowe CAD mogą wspierać HEp-2 IFA. Nowe wytyczne promują etapowe podejście do diagnostyki, które rozpoczyna się od wykonania testu przesiewowego ANA metodą HEp-2 IFA, następnie, w przypadku wyniku pozytywnego, należy wykonać bardziej szczegółowe badania potwierdzające. Wybór testu potwierdzenia uzależniony jest od wzoru świecenia przeciwciał zidentyfikowanego w teście przesiewowym. Takie podejście ma na celu optymalizację ścieżki diagnostycznej, poprawę jakości diagnostyki oraz zwiększenie wartości klinicznej uzyskanych wyników.
Nowe rekomendacje EFLM, EASI i ICAP są istotnym krokiem w stronę zapewnienia wysokiej jakości badań diagnostycznych ANA. Jednym z głównych celów nowych wytycznych jest zwiększenie standaryzacji metod detekcji ANA oraz interpretacji wyników. Ujednolicenie metod diagnostycznych, doprecyzowanie metodyki wykonywania badań, raportowanie miana oraz wzorów świeceń ANA, a także algorytmiczne podejście do diagnostyki mają na celu poprawę dokładności i spójności wydawanych wyników. Zastosowanie nowych wytycznych w praktyce laboratoryjnej i klinicznej pozwoli na bardziej precyzyjne rozpoznawanie chorób autoimmunizacyjnych, co przekłada się na lepszą opiekę nad pacjentem.
Warto podkreślić, że w zespołach, które pracowały nad nowymi rekomendacjami detekcji ANA, znaleźli się polscy eksperci: dr n. med. Katarzyna Fischer, prof. dr hab. n. med. Marek Brzosko, prof. dr hab. n. med. Eugeniusz J. Kucharz, dr hab. n. med. Bogdan Batko, prof. dr hab. n. med. Zbigniew Żuber, dr n. med. Piotr Dąbrowski. Firma EUROIMMUN Polska odpowiedzialna była za przygotowanie tłumaczenia rekomendacji, co stanowi dla nas niezwykłe wyróżnienie. Jesteśmy dumni, że możemy propagować diagnostykę laboratoryjną opartą o wiarygodne i trafne testy laboratoryjne. Od lat promujemy przeprowadzanie badań serologicznych we właściwy sposób i zgodnie ze stanem najnowszej wiedzy medycznej.
Opracowano na podstawie: Bonroy C., Vercammen M., Fierz W. et al., Rekomendacje EFLM, EASI oraz ICAP: Detekcja przeciwciał przeciwjądrowych, Publikacja EFLM. Diagn Lab. (2024); 60 (2): 38–83, https://doi.org/10.5604/01.3001.0054.6716.
Anna Kołtyś
Specjalista ds. Informacji Naukowej, Product Manager ds. Autoimmunologii