Gruźlica, która jest jedną z najstarszych chorób zakaźnych w dziejach ludzkości, wciąż plasuje się w grupie chorób odpowiadających za największą liczbę zgonów na świecie. U większości zakażonych choroba występuje w postaci latentnej i nie wywołuje żadnych objawów, jednak u 10% postać latentna przekształca się w aktywną. W związku z tym, że gruźlica wciąż stanowi realny ogólnoświatowy problem zdrowotny, tak kluczowa jest jej prawidłowa diagnostyka.

W przypadku gruźlicy znanych jest wiele metod diagnostycznych różniących się czułością, swoistością, czasem oczekiwania na wynik, jak również zastosowaniem, gdyż część metod stosuje się w przypadku podejrzenia aktywnej gruźlicy, a część przy diagnozowaniu gruźlicy latentnej. W niniejszym artykule zostaną opisane dwie nowoczesne metody wykrywania zakażenia prątkiem gruźlicy: badanie przeprowadzone techniką biologii molekularnej – PCR oraz test oparty o metodę ELISPOT służący do oceny komórkowej odpowiedzi immunologicznej.

Diagnostyka aktywnej gruźlicy: badanie genetyczne – EURORealTime MTB (EUROIMMUN)

Badania molekularne odgrywają dużą rolę w diagnostyce gruźlicy i są one coraz częściej wymieniane w zaleceniach diagnostycznych ze względu na swoją wysoką czułość i szybkość otrzymania wyniku (kilka godzin dla PCR versus kilka tygodni dla hodowli). Metody molekularne są rekomendowane u pacjentów z podejrzeniem aktywnej gruźlicy płuc, gdy szybkie uzyskanie wyniku jest kluczowe i pozwala na natychmiastowe wdrożenie leczenia. Dodatni wynik należy potwierdzić poprzez wykonanie posiewu bakteryjnego na pożywkach stałych lub płynnych, dlatego badania PCR zaleca się prowadzić równolegle do hodowli/mikroskopii.

Firma EUROIMMUN w swojej ofercie posiada test EURORealTime MTB w kierunku genetycznej diagnostyki zakażeń prątkami gruźlicy, który zapewnia bardzo czułą detekcję (LoD = 0,5 cp/µl) wszystkich gatunków prątków z grupy M. tuberculosis complex (MTBC). Dzięki wykrywaniu 3 różnych regionów genetycznych metoda ta obejmuje wiele wariantów genetycznych MTBC. Detekcja DNA bakteryjnego może być przeprowadzona z różnych materiałów pobranych od pacjenta, takich jak plwocina, popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) i wydzielina oskrzelowa. Na podstawie analizy porównawczej z innym testem PCR wykazano czułość EURORealTime MTB na poziomie 95,8%, a swoistość wynosiła 100%. Dużą zaletą testu jest bardzo krótki czas przeprowadzenia reakcji (80 minut), co jest szczególnie istotne w badaniach przesiewowych. Test ten został zwalidowany na urządzeniach różnych producentów (Roche LightCycler 480II, ABI 7500 Fast), dzięki czemu możliwe jest jego łatwe wdrożenie w wielu laboratoriach. Ponadto wszystkie wymagane odczynniki (w tym kontrola wewnętrzna i pozytywna kontrola zewnętrzna) zawarte są w zestawie testowym, a automatyczna ocena wyników jest wspomagana przez oprogramowanie EURORealTime Analysis.

Diagnostyka latentnego zakażenia prątkiem gruźlicy: badanie odpowiedzi komórkowej – T-SPOT.TB (Oxford Immunotec)

Testy typu IGRA służą do diagnostyki latentnej postaci gruźlicy. W porównaniu do próby tuberkulinowej (testy TST) cechuje je wyższa specyficzność. Ponadto na wynik testów typu IGRA nie wpływa szczepienie BCG. Testy IGRA opierają się na ocenie komórkowej odpowiedzi immunologicznej, czyli na analizie aktywności limfocytów T wytwarzających interferon gamma na skutek stymulacji specyficznymi antygenami prątka gruźlicy. W tej kategorii wyróżnia się testy oparte o metodę ELISPOT (ang. Enzyme-Linked Immunospot), takie jak T-SPOT.TB firmy Oxford Immunotec, które firma EUROIMMUN posiada w swojej ofercie.

Standardowa procedura wykonania testu opartego o metodę ELISPOT polega na izolacji jednojądrzastych komórek krwi obwodowej PBMC (ang. Peripheral Blood Mononuclear Cell), w skład których wchodzą limfocyty T. Aby pozbyć się czynników interferujących, są one przemywane, a następnie liczone w celu przygotowania wystandaryzowanej zawiesiny komórkowej dla każdego pacjenta. Odpowiednia liczba komórek jest nanoszona na płytki mikrotitracyjne, opłaszczone przeciwciałami anty-interferon gamma, i stymulowana wysokospecyficznymi antygenami Mycobacterium tuberculosis. W przypadku wcześniejszego kontaktu pacjenta z patogenem, dochodzi do produkcji cytokiny. W następstwie reakcji immunoenzymatycznej na membranach w dołkach płytki powstają barwne plamki, tzw. spoty. Wynik badania interpretuje się w zależności od ich ilości. Badanie metodą ELISPOT jest szczególnie rekomendowane w przypadku osób o obniżonej odporności, do której zaliczamy pacjentów po chemioterapii, przyjmujących leki immunosupresyjne, po przeszczepie narządów, zakażonych wirusem HIV, chorych na choroby autoimmunizacyjne, a także dzieci czy osoby starsze.

Test T-SPOT.TB można przeprowadzić w sposób manualny, jak również istnieje możliwość automatyzacji poszczególnych jego etapów, takich jak izolacja i liczenie komórek PBMC oraz zliczanie plamek w celu interpretacji wyniku. Ten końcowy etap można przeprowadzić nawet przy użyciu szkła powiększającego, a także mikroskopu lub stosując bardziej zaawansowaną technologię w postaci czytnika płytek ELISPOT.

Piśmiennictwo

1. Augustynowicz-Kopeć E., Zwolska Z., Mikrobiologiczna diagnostyka gruźlicy oraz zasady ochrony pacjentów i pracowników przed zakażeniami wywołanymi prątkami gruźlicy, Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Chorób Płuc Krajowej Izby Diagnostów Laboratoryjnych (2013).
2. Borkowska D., Zwolska Z. i in., Interferonowy test T-SPOT.TB w diagnostyce latentnego zakażenia prątkiem gruźlicy, Pneumonol. Alergol. Pol (2011).
3. Materiały firmy Euroimmun: Ulotka EURORealTime MTB, Euroimmun.
4. Materiały firmy Oxford Immunotec: T-SPOT.TB, Oxford Immunotec (https://www.tspot.com/uk/) [dostęp: 31.03.2022].