Wywiad ze Stanisławem Polańskim diagnostą laboratoryjnym z Zakładu Diagnostyki Biochemicznej i Molekularnej Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie

Diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych, mimo znaczących postępów w medycynie, nadal bywa czasochłonna i niejednoznaczna. Z czego wynikają trudności w rozpoznawaniu tych schorzeń?

Diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych jest procesem złożonym. Dzieje się tak z kilku powodów. Podstawową metodą pozostaje immunofluorescencja pośrednia, która wymaga od diagnosty dużego doświadczenia. Sama procedura jest wieloetapowa i obejmuje m.in. inkubację substratów z surowicą pacjenta, a następnie z odpowiednim koniugatem.

W przypadku badań przeciwciał, takich jak ANA, ANCA czy anty-dsDNA, kiedy konieczne jest określenie ich miana, dodatnie próbki wymagają ponownego przygotowania w innym rozcieńczeniu, aby umożliwić uzyskanie ostatecznego wyniku. Wszystko to sprawia, że czas diagnostyki może wynosić – w zależności od laboratorium – od 1 do 3 dni.

W odróżnieniu od diagnostyki biochemicznej wiele małych i średnich laboratoriów nie dysponuje urządzeniami, które umożliwiają pełną automatyzację w zakresie badań autoimmunologicznych. Znaczna część testów wykonywana jest manualnie, co może wydłużać czas oczekiwania na wynik. Dodatkowo w mniejszych placówkach niewystarczająca liczba próbek dla rzadziej zlecanych testów uniemożliwia wykonywanie oznaczeń na bieżąco i wymaga oczekiwania na zebranie odpowiedniej liczby próbek.

W laboratorium autoimmunologicznym, zwłaszcza takim, które oferuje szeroki zakres badań i wykorzystuje różnorodne techniki – np. immunofluorescencję pośrednią, immunoblotting czy testy ELISA – czas oczekiwania na wynik może się różnić w zależności od liczby zleconych parametrów oraz zastosowanych metod analitycznych.

W diagnostyce przeciwciał przeciwjądrowych, gdy stosuje się kilka metod równolegle, mogą pojawić się rozbieżności w wynikach. Najczęstszą przyczyną takich sytuacji są różnice w prezentacji antygenów wykorzystywanych do konstrukcji poszczególnych testów. Antygeny prezentowane w komórkach linii HEp-2 różnią się od tych obecnych na paskach immunoblotu czy na dnie studzienek testów ELISA.

Dodatkowo surowica pacjenta może zawierać inne przeciwciała lub białka interferujące z podłożem bądź substratem testu, co może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych, a także utrudniać interpretację ze względu na mniejszą czytelność obrazu.

Kolejnym źródłem niezgodności może być stosowanie testów pochodzących od różnych producentów. Każda firma biotechnologiczna korzysta z własnych technologii, procedur oraz unikatowych źródeł antygenów, co wpływa na ostateczne parametry testów. Choć sytuacje takie zdarzają się stosunkowo rzadko, mogą istotnie wydłużać cały proces diagnostyczny.

Jaką rolę według Pana odgrywa współpraca lekarza z diagnostą laboratoryjnym? Czy diagnosta laboratoryjny może być realnym wsparciem dla klinicysty?

Oczywiście, że tak – współpraca diagnosty laboratoryjnego z lekarzem jest kluczowa i stanowi realne, nieocenione wsparcie dla klinicysty na każdym etapie procesu diagnostyczno-terapeutycznego. Współpraca ta opiera się na wymianie wyspecjalizowanej wiedzy, a trafna diagnoza i skuteczne leczenie w dużej mierze zależą od jakości oraz wiarygodności wyników badań laboratoryjnych. Szacuje się, że nawet 60–70% decyzji lekarskich podejmowanych jest na podstawie rezultatów pracy diagnostów. Diagnosta laboratoryjny odpowiada za wszystkie etapy procesu analitycznego – przedanalityczny, analityczny i postanalityczny – dostarczając lekarzowi obiektywnych danych, niezbędnych do postawienia diagnozy, monitorowania terapii, oceny rokowania czy działań profilaktycznych.

Współczesny diagnosta laboratoryjny jest ekspertem w swojej dziedzinie. Jego rola wykracza daleko poza samo wykonywanie badań. Specjalista ten pomaga w wyborze najbardziej odpowiednich testów, interpretuje wyniki – zwłaszcza te nietypowe lub niejednoznaczne – oraz informuje lekarzy o wszelkich potencjalnych nieprawidłowościach. Ponadto czuwa nad jakością i bezpieczeństwem procesu diagnostycznego poprzez stałą kontrolę jakości, nadzór nad aparaturą, walidację metod oraz bieżącą ocenę poprawności parametrów. Wszystko to służy temu, aby wyniki przekazywane lekarzowi były rzetelne i wiarygodne.

Praca diagnosty laboratoryjnego istotnie wpływa na decyzje terapeutyczne podejmowane przez lekarzy. Odpowiednio dobrane badania – szczególnie w takich dziedzinach jak genetyka, immunologia czy mikrobiologia – dostarczają kluczowych informacji, które zwiększają precyzję leczenia, skracają czas terapii i wspierają optymalizację kosztów.

W całym procesie nie można pominąć znaczenia prawidłowej komunikacji na linii lekarz–diagnosta oraz lekarz–laboratorium. Nawet najlepsza aparatura i najszersza oferta testów nie przyniosą oczekiwanych rezultatów bez sprawnego przepływu informacji dotyczących dostępnych metod, alternatywnych rozwiązań czy możliwości danego laboratorium.

Pracując w dużym szpitalu klinicznym, dysponujemy dobrze rozwiniętą pracownią autoimmunologiczną, którą stale modernizujemy. Codziennie otrzymujemy dziesiątki zleceń, przy których zdarzają się różnego rodzaju trudności: zlecenia zdublowane, pytania o badania znajdujące się w naszej ofercie czy błędnie dobierane testy. Lekarze wskazują, że jednym z głównych powodów tych problemów jest ogrom obowiązków związanych z leczeniem pacjentów oraz dokumentacją medyczną. Doświadczeni lekarze często nie mają czasu, aby przeszkolić młodszych kolegów w zakresie właściwego zlecania badań czy znajomości oferty laboratorium.

Właśnie dlatego wprowadziliśmy cykliczne spotkania z lekarzami poszczególnych oddziałów i poradni. Podczas tych spotkań prezentujemy możliwości diagnostyczne laboratorium, omawiamy dostępne badania oraz rozwiewamy wszelkie wątpliwości, co znacząco usprawnia współpracę. Dzięki takim inicjatywom udało nam się m.in. rozszerzyć ofertę o kilka nowych badań, lepiej dopasowanych do potrzeb klinicznych.

W ostatnich latach obserwujemy ogromny rozwój immunologii i technik diagnostycznych. Jakie metody uważa Pan za prawdziwy przełom? Czy dostrzega Pan obszary, które nadal wymagają doskonalenia?

W diagnostyce immunologicznej w ostatnich latach zaszło wiele istotnych zmian, jednak jedną z najbardziej znaczących jest rozwój metody immunoblottingu. Gdy ponad 20 lat temu rozpoczynałem pracę w dziedzinie autoimmunologii, obok podstawowej metody immunofluorescencji pośredniej drugim kluczowym narzędziem wykorzystywanym do wykrywania autoprzeciwciał była podwójna immunodyfuzja w żelu agarozowym według Ouchterlony’ego (DID). Metoda ta polegała na zestawieniu w żelu agarozowym ekstraktu bogatoantygenowego z grasicy cielęcej z surowicą pacjenta (Rys. 1). W przypadku obecności odpowiednich przeciwciał w żelu tworzyła się linia precypitacyjna.

Rys. 1. Metoda DID wg Ouchterlony’ego

Była to technika niezwykle pracochłonna – pierwsza inkubacja trwała 48 godzin w temperaturze 4–8°C. Jeśli w surowicy obserwowano linię precypitacyjną, reakcję powtarzano w innej konfiguracji, zestawiając badaną surowicę z surowicami wzorcowymi. Pokrywanie się linii świadczyło o obecności przeciwciał identycznych jak w surowicy referencyjnej, natomiast linie przecinające się wskazywały na obecność innych autoprzeciwciał.

Metoda DID była w pełni home made: ekstrakty antygenowe, żele agarozowe i surowice wzorcowe – będące surowicami pacjentów – sprawiały, że czułość i swoistość testów były zmienne, a w skrajnych przypadkach identyfikacja jednej surowicy mogła trwać nawet 2 tygodnie. W tamtym czasie metody immunoblottingu nie były jeszcze powszechnie dostępne, a dostępne komercyjnie testy były kosztowne w porównaniu z DID.

W ciągu ostatnich kilkunastu lat nastąpił intensywny rozwój techniki immunoblottingu. Testy stały się bardziej przystępne cenowo, co umożliwiło ich rutynowe stosowanie. Równocześnie zidentyfikowano i scharakteryzowano wiele nowych antygenów, znacznie rozszerzając zakres możliwych do wykrycia przeciwciał. Pierwsze testy blot umożliwiały oznaczanie kilku podstawowych autoprzeciwciał, takich jak SS-A (Ro), SS-B (La), Scl-70, PM-Scl, Jo-1, nRNP czy Sm. Obecnie za pomocą immunoblotów można wykrywać kilkadziesiąt różnych autoprzeciwciał.

Aby ułatwić diagnostykę i ukierunkować ją na konkretne jednostki chorobowe, producenci zaczęli tworzyć zróżnicowane panele tematyczne – od podstawowych paneli ENA po bardziej specjalistyczne zestawy przeznaczone do diagnostyki miopatii zapalnych, twardziny układowej, chorób neurologicznych czy autoimmunologicznego zapalenia wątroby.

Współcześnie immunobloty oferowane są głównie w formie pasków, co wiąże się z ograniczeniami dotyczącymi liczby badań wykonywanych jednocześnie. W dużych laboratoriach korzystnym rozwiązaniem jest wprowadzenie testów typu mikroblot, czyli zminiaturyzowanej wersji immunoblotu, opartej na formacie płytek 96-dołkowych. Taka technologia zwiększa przepustowość pracowni i usprawnia analizę dużej liczby próbek.

Jakie przesłanie chciałby Pan skierować do młodych lekarzy i diagnostów, którzy dopiero rozpoczynają swoją karierę zawodową? Jakie błędy najczęściej popełniają początkujący specjaliści?

Młodzi lekarze rozpoczynający swoją praktykę powinni nie tylko korzystać z aktualnej literatury medycznej i wskazówek bardziej doświadczonych kolegów – co jest oczywistością – lecz także utrzymywać regularny kontakt z laboratorium diagnostycznym. Uważam, że szczególnie wartościowa jest wizyta w laboratorium dysponującym pracownią autoimmunologiczną. Nasza jednostka jest otwarta na tego typu współpracę, a z doświadczenia wiem, że spotkania te są niezwykle owocne: zarówno diagnosta, jak i lekarz wynoszą z nich nowe, praktyczne informacje, które przekładają się na lepszą komunikację i skuteczniejszą współpracę.

W przypadku początkujących diagnostów laboratoryjnych, stawiających pierwsze kroki w autoimmunologii, kluczowe jest systematyczne zdobywanie doświadczenia zawodowego, rozwijane przez wiele lat. Podstawową metodą w tej dziedzinie jest immunofluorescencja pośrednia oceniana przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta wymaga od diagnosty wysokiego poziomu wprawy i precyzji. Aby prawidłowo rozpoznawać wzory świecenia oraz oceniać miana przeciwciał, konieczne jest obejrzenie bardzo dużej liczby preparatów – nierzadko tysięcy – w ciągu wielu tygodni lub miesięcy, pod nadzorem doświadczonego specjalisty.

Najczęstszym problemem początkujących diagnostów jest trudność w prawidłowej interpretacji wzorów świecenia. Wynika to zwykle z niewystarczającego doświadczenia lub z faktu, że w mniejszych laboratoriach liczba wykonywanych badań jest zbyt mała, by umożliwić szybkie nabycie odpowiednich kompetencji. Kolejnym często spotykanym wyzwaniem jest tendencja do zawyżania wyników. W immunofluorescencji pośredniej wynik uznaje się za dodatni, gdy obserwuje się fluorescencję struktur komórkowych – zieloną lub w przypadku wysokich mian żółto-zieloną. W preparatach ujemnych widoczne są kontury komórek, cytoplazma czy inne elementy substratu, co osoby niedoświadczone mogą błędnie interpretować jako słabą reakcję dodatnią. Prowadzi to do niepotrzebnego kwalifikowania wyników jako graniczne lub dodatnie, a w konsekwencji do zawyżania mian oraz zwiększania kosztów badania.

Dlatego tak istotne jest ciągłe kształcenie, udział w szkoleniach, praca pod okiem doświadczonych diagnostów oraz regularne analizowanie dużej liczby preparatów. Tylko dzięki temu możliwe jest zapewnienie wysokiej jakości diagnostyki w zakresie chorób autoimmunizacyjnych.

Dziękuję za rozmowę.

Rozmawiała: Anna Kołtyś