Wywiad z mgr Marzeną Kraską-Gacką, specjalistką ds. badań laboratoryjnych, Diagnostą Laboratoryjnym z Pracowni Diagnostyki Dermatologicznej USK2 UM w Łodzi przy Klinice Dermatologii i Wenerologii Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego nr 2 UM w Łodzi

Diagnostyka autoimmunizacyjnych chorób pęcherzowych skóry (ang. autoimmune blistering diseases, AIBD) stanowi istotne wyzwanie – m.in. ze względu na ich stosunkowo rzadkie występowanie oraz zróżnicowany obraz kliniczny. Jak wygląda to w Państwa codziennej praktyce? Które jednostki chorobowe z tej grupy najczęściej diagnozują Państwo w swoim ośrodku?

Diagnostyka autoimmunizacyjnych chorób pęcherzowych skóry bywa bardzo trudna. Jest ona złożona i wieloetapowa, do czego przyczynia się rzadkość występowania tych schorzeń oraz ich różnorodny obraz kliniczny, który często nastręcza problemów przy ustalaniu rozpoznania. W codziennej praktyce trafia się mało „książkowych przypadków”.

Choroby pęcherzowe na początkowych etapach mogą być mylone z innymi jednostkami chorobowymi, m.in. z wypryskiem, świądem starczym, infekcjami jamy ustnej, aftami, nadżerkami pourazowymi, opryszczką bądź liszajem, a to tylko część przykładów. Niespecyficzne objawy i zmiany mogą utrzymywać się tygodniami, a nawet miesiącami, zanim osiągną pełny obraz kliniczny, charakterystyczny dla danej jednostki chorobowej. Wydłuża to proces diagnostyczny i odsuwa w czasie prawidłowe rozpoznanie. W związku z tym opóźniona zostaje również diagnostyka laboratoryjna. Dodatkowo leczenie stosowane w czasie poszukiwań przyczyn zmian i objawów może zacierać faktyczny obraz chorobowy. Są to pułapki diagnostyczne, których nie da się uniknąć, a które mogą zaburzać i wygaszać obraz immunologiczny. Diagnostyka AIBD to wieloetapowy proces wymagający precyzji i doświadczenia. Obecnie spotykamy się coraz częściej z niespecyficznym obrazem w badaniach laboratoryjnych, który odbiega od znanych nam kryteriów i algorytmów postępowania. W tym momencie diagnosta musi mieć otwarty umysł i być elastyczny w ocenie oraz doborze narzędzi do wykonania badań, a także mieć duże doświadczenie w tym, co robi. Odgrywa ono ogromną rolę w rozpoznaniu „podejrzanego” obrazu i umiejętności zweryfikowania go wszelkimi dostępnymi środkami. Immunologia potrafi płatać figle, co jest naszą zmorą, zwłaszcza przy chorobach rzadkich. Mimo iż posiadamy wiele zróżnicowanych testów diagnostycznych, które są naszą bronią w walce z niejasnościami obrazu, bez dużej wiedzy i praktyki możemy polec w tej bitwie, co niestety wpływa na niekorzyść pacjenta. Nasza Pracownia Diagnostyki Dermatologicznej ma w swojej ofercie szeroką gamę testów diagnostycznych, które wykorzystujemy w pracy laboratoryjnej. Wykonujemy badania z zakresu diagnostyki pośredniej, jak i bezpośredniej, a mimo to czasami mamy bardzo trudny orzech do zgryzienia przy ocenie. Odnosząc się do pytania o to, które jednostki z tej grupy najczęściej diagnozujemy – mogę stwierdzić z uśmiechem, że wszystkie, może z wyjątkiem pęcherzycy paraneoplastycznej (PNP), która na całe szczęście występuje rzadko. Codziennie trafiają do nas próbki od pacjentów z różnych jednostek dermatologicznych z całego kraju i śmiało możemy się powiedzieć, że materiału do badań nie jest mało.

Jakie autoprzeciwciała mają obecnie kluczowe znaczenie w diagnostyce AIBD? Czy w swojej praktyce korzystają Państwo z paneli autoprzeciwciał? W jakich sytuacjach klinicznych warto wybrać szerszy profil autoprzeciwciał?

W zależności od jednostki chorobowej wyodrębniamy kluczowe autoprzeciwciała charakterystyczne dla danego rozpoznania. Przeciwciała krążące wykrywamy w surowicy, wykorzystując testy z zakresu immunofluorescencji pośredniej (IIFT) oraz ELISA. Dzięki szerokiej ofercie firmy Euroimmun, której jesteśmy fanami, mówiąc kolokwialnie – możemy poszaleć. Oprócz oznaczania pojedynczych podstawowych parametrów przypisanych do konkretnej jednostki chorobowej możemy wykorzystywać panele autoprzeciwciał. Chcę podkreślić, że dla mnie słowo „panel” określa szereg różnych antygenów dostępnych w jednej przestrzeni oznaczeń niezależnie od metodyki. Wasza oferta odczynnikowa jest bardzo dobrze przystosowana do naszych oczekiwań, przez co jesteśmy w stanie w sposób istotny skrócić diagnostykę, jednocześnie mając szersze spojrzenie na problem. Wykorzystujemy profile (IIFT) z biochipami zawierającymi tkanki (przełyk małpy, split), transfekowane komórki (Des1/3, BP230), oczyszczone antygeny (BP180) oraz profile ELISA ze studzienkami, w których znajdują się wyselekcjonowane antygeny (BP180, BP230, Des1, Des3, kolagen VII, enwoplakina). Zastosowanie rozszerzonej diagnostyki, w której wykorzystujemy m.in. panele, ma znaczenie w przypadkach, kiedy liczy się czas, występuje nietypowy obraz kliniczny ze zmianami mieszanymi bądź przy braku klasycznej lokalizacji zmian. Jest to również bardzo istotne, kiedy wykrywamy niezgodności w wynikach badań, porównując je z obrazem klinicznym, i kiedy stykamy się z rzadką chorobą.

Cieszymy się, że mamy możliwość korzystania zarówno z pojedynczych testów, jak i z profili. Faktem jednak jest, że pojedyncze oznaczenia, bez możliwości podejrzenia całości, mogą dawać fałszywie dodatnie lub fałszywie ujemne wyniki, które stanowią ograniczenie na drodze do wykrycia choroby. Mogę to porównać do jazdy MPK i luksusowym samochodem z kierowcą. Oczywiście oba środki zapewniają dotarcie do wyznaczonego punktu, jednakże w różnym czasie. Osobiście zdecydowanie wolę jazdę zapewniającą luksusowe warunki, dzięki którym mogę obserwować swobodnie całe otoczenie podczas krótszej drogi.

W przypadku pęcherzycy (łac. Pemphigus) kluczowymi antygenami stosowanymi w diagnostyce są desmogleiny 1 (Des1) i 3 (Des3) – białka w strukturze desmosomów odpowiadające za połączenie międzykomórkowe – dlatego wykorzystujemy techniki pozwalające wykryć przeciwciała przeciwko Des1 i Des3. Wyróżniamy kilka postaci pęcherzycy i w zależności od typu oczekujemy odpowiednio pozytywnych wyników:

• pęcherzyca zwykła (łac. Pemphigus vulgaris, PV) – przeciwciała anty-Des1 i anty-Des3;
• pęcherzyca liściasta (łac. Pemphigus foliaceus, PF) – przeciwciała anty-Des1;
• pęcherzyca IgA (łac. IgA-Pemphigus) – przeciwciała anty-Des1 i anty-Des3.

Przypadkiem, w którym rozszerzamy diagnostykę serologiczną, jest pęcherzyca paraneoplastyczna (łac. Paraneoplastic pemphigus, PNP) – szukamy dodatniej odpowiedzi w antygenach: Des1, Des3, BP230 i enwoplakina. Dzięki panelom jesteśmy w stanie zrobić to w jednym podejściu.

Kolejnymi schorzeniami skóry są podnaskórkowe dermatozy pęcherzowe (łac. pemphigoid). Klinicznie wyróżniamy następujące typy tych dermatoz, potwierdzane dodatnimi wynikami odpowiednich przeciwciał:

• pemfigoid pęcherzowy (łac. Bullous pemphigoid, BP) – anty-BP180, anty-BP230;
• pemfigoid błon śluzowych (łac. Mucous membrane pemphigoid, MMP) – anty-BP180, anty-laminina 332;
• linijna IgA choroba pęcherzowa (łac. Linear IgA bullous dermatosis, LABD) – anty-BP180, anty-kolagen typu VII’
• pemfigoid ciężarnych (łac. Pemphigoid gestationis, PG) – anty-BP180, anty-BP230;
• nabyte pęcherzowe oddzielanie się naskórka (łac. Epidermolysis bullosa acquisita, EBA) – anty-kolagen typu VII;
• pemfigoid anty-p200 (ang. anti-p200 pemphigoid), dla którego oznaczenie przeciwciał przeciwko charakterystycznym antygenom (laminina γ1, laminina β4) niestety pozostaje w sferze oznaczeń w badaniach naukowych. Czekamy, aż będziemy mogli rozszerzyć naszą diagnostykę o te parametry w oznaczeniach komercyjnych.

Jaką rolę w procesie diagnostycznym odgrywa współpraca lekarza z diagnostą laboratoryjnym? Czy dialog między klinicystą a laboratorium jest kluczowy dla ustalenia trafnego rozpoznania? Czy diagnosta laboratoryjny może stanowić realne wsparcie w interpretacji wyników?

Można śmiało powiedzieć, że współpraca lekarza z diagnostą laboratoryjnym jest kluczowym elementem całego toku diagnostycznego, prowadzącego do postawienia ostatecznej diagnozy. Diagnosta i klinicysta to dwa najważniejsze filary w tym procesie, które samodzielnie nie są wystarczające w swoich działaniach na rzecz pacjenta. Diagnosta jest w stanie zobaczyć rzeczy nieuchwytne dla lekarza. Dzięki dostępnym technikom, które wykorzystujemy w procesie wykonywania badania, widzimy wzory, wskazujące nam drogę w tym zadaniu. Na podstawie uzyskanych „tropów” potwierdzamy, zaprzeczamy bądź obieramy nowy kierunek w odniesieniu do rozpatrywanego przypadku i dzielimy się nim z zainteresowanymi. Kiedy współpraca z lekarzem jest ograniczona bądź nie występuje wcale, każde oznaczenie jest tylko suchym wynikiem, który może ukazywać fałszywy obraz, co jest szczególnie istotne przy nietypowych i rzadkich przypadkach czy też występowaniu niespójności w wynikach. Diagnosta, mając do dyspozycji informacje od klinicysty dotyczące badanego pacjenta, po uzyskaniu wyników ze zlecenia jest w stanie zaproponować kolejne kroki, jeżeli zaobserwuje coś nieoczywistego. Dodatkowo osoby pracujące w laboratorium są pierwszą linią obrony przed błędami przedlaboratoryjnymi. To my widzimy, czy materiał jest odpowiedni i czy możemy na nim pracować. Jeżeli mamy możliwość współpracy, skraca to czas do ponownego dostarczenia materiału, co przekłada się na całkowity czas potrzebny do postawienia diagnozy. Dlatego takie pracownie jak nasza są na uprzywilejowanej pozycji, mamy możliwość stałego dialogu z lekarzami, co ułatwia pracę zarówno nam, jak i klinicystom. Nasza pracownia jest z tego znana w naszym obszarze działań, że wraz ze zlecającymi badania wspieramy się wzajemnie, dyskutujemy i rozpatrujemy różne warianty postępowania, jakie możemy zastosować.

Jakie są najczęstsze trudności i pułapki w diagnostyce serologicznej AIBD? Jakie wyzwania pojawiają się w diagnostyce różnicowej tych chorób?

Wykonując diagnostykę w kierunku chorób pęcherzowych, musimy pamiętać, że serologia to tylko wierzchołek góry lodowej. Niezwykle ważna jest współpraca z lekarza z diagnostą i interpretacja uzyskanych wyników.  Żeby można było ustalić prawidłowe rozpoznanie, należy skorelować ze sobą kilka czynników, tj. klinikę pacjenta, serologię, DIF (wycinek immunopatologiczny, który nadal pozostaje nadrzędny w stosunku do serologii). Stwarza to warunki do występowania pułapek, których jest całkiem sporo. Nasza głowa w tym, by w te pułapki nie wpaść. Ważne jest, by przyswoić sobie kilka prostych zasad:

• DIF to fundament diagnostyki.
• Ujemna serologia nie wyklucza występowania chorób pęcherzowych.
• Dodatnia serologia nie potwierdza AIBD bez kliniki i DIF.
• W trudnych przypadkach należy rozszerzyć diagnostykę i wykorzystywać dostępne panele autoprzeciwciał.
• Nie należy ograniczać się do jednej metodyki, gdy klinika nie współgra z uzyskanymi wynikami badań.
• Nie powinno się brać niczego za rzecz oczywistą i pewną. Wyznaczone schematy badań są naszym filarem, ale nie całą budowlą (ta ostatnia zasada jest według mnie najważniejsza).

Dokładnie można to zobrazować, przytaczając przykłady trudności i pułapek, które na nas czyhają w lesie diagnostyki serologicznej. Jest ich wiele, dlatego w naszej pracy tak ważne jest doświadczenie i ciągłe doszkalanie się. Ze względu na stosowane leczenie, okres, w którym wykonujemy badania, ograniczenia testu do pojedynczego antygenu, brak uniwersalnego schematu u pacjentów z powodu różnic osobniczych oraz czynników zewnętrznych i wewnętrznych mamy utrudniony proces diagnostyczny. Dodatkowo proces różnicowy jest szczególnie trudny, ponieważ wiele chorób ma podobny obraz kliniczny i immunologiczny. Pemfigus vs pemfigoidy stwarza problem na poziomie rozszczepu – splitu – dlatego sama serologia nie wystarcza (pemfigus – śródnaskórkowy rozpad, pemfigoidy – podnaskórkowy rozpad). Prawidłowe określenie kierunku rozpoznania przez lekarza jest dla nas bardzo istotne. Jeżeli mamy konkretne wskazanie, nie ma problemu. Schody zaczynają się wtedy, gdy dostajemy skierowanie ze stwierdzeniem „przeciwciała w chorobach pęcherzowych”. Oprócz serologii konieczny jest DIF. Dlaczego? No cóż, z przeciwciałami różnie bywa, mogą być lub może ich nie być ze względu na różne oddziaływania. Szczególnie trudnymi przypadkami do różnicowania są MMP vs BP vs EBA. Wszystkie są z rodziny pemfigoidów, więc dają podobny obraz w DIF. Zastosowanie samej serologii nierozszerzonej stwarza ryzyko błędnej interpretacji uzyskanych wyników. W pemfigoidzie błon śluzowych obserwujemy częsty brak przeciwciał. Pemfigoid pęcherzowy powinien odpowiadać przeciwko BP180 i BP230, niestety zdarzają się przypadki, gdy tych przeciwciał nie jesteśmy w stanie określić. EBA (pęcherzowe oddzielanie się naskórka) to nasza zmora. Teoretycznie w rozszerzonej diagnostyce powinien odpowiedzieć kolagen VII. Proste? Oczywiście, ale w praktyce różnie to bywa. W badanych przez nas próbach z tym rozpoznaniem występuje cała plejada gwiazd. Immunologia u tych pacjentów płata okropne figle. Jednocześnie potrafią występować przeciwciała przeciw desmogleinom, enwoplakinom, BP180, BP230, kolagenowi VII, i to w różnych kombinacjach. I bądź tu człowieku mądry i pisz wiersze. Bez współpracy i wykorzystania wszelkich technik (obraz kliniczny, DIF standardowy, split, histopatologia, rozszerzone profile zarówno IIFT, jak i ELISA) nie zrobilibyśmy nic sensownego. Wszystko można by było określać jako niespecyficzne występowanie przeciwciał. Wyzwaniem, które stawia nas w gotowości bojowej, jest nakładanie się obrazów klinicznych, przez co może występować atypowy przebieg. Przekłada się to na występowanie przeciwciał. Tutaj nie ma klarownego postępowania, musimy podchodzić do tego oznaczenia wieloetapowo, wykorzystując naszą wiedzę i doświadczenie. W obecnej dobie immunologia ludzi jest tak nadreaktywna, że obraz przeciwciał bywa bardzo mylący, jeżeli nie odnosimy się odpowiednio do całości. Obserwujemy bardzo dużo niespecyficznych typów świeceń w IIFT, które w jednostkach z nikłym doświadczeniem są brane jako dodatnie, ze względu na testy z pojedynczymi antygenami. Jedno jest pewne, bez całokształtu i rozszerzonej diagnostyki w tym momencie dajemy podstawy lekarzom do błędnej interpretacji i błędnego rozpoznania.

Czy mogłaby Pani podzielić się przykładem szczególnie interesującego przypadku diagnostycznego, który zapadł w pamięć – zwłaszcza takiego, w którym badanie autoprzeciwciał odegrało kluczową rolę?

Szczerze mówiąc, nie wiem, co mogłabym uznać za szczególnie interesujący przypadek. W naszej pracowni są same dziwne przypadki, które dla nas są normą. Mamy zróżnicowaną diagnostykę i możliwość korzystania jednocześnie ze wszystkich potrzebnych technik (DIF, IIFT, ELISA), dlatego bywamy jak dr House diagnostyki laboratoryjnej. A to dzięki temu, że posiadamy wszelkie możliwe testy do różnicowania chorób pęcherzowych dostępne na rynku. Dobrze, że Euroimmun ma tak bogatą ofertę odczynników. Dlatego szukamy ku chwale nauki i rozpatrujemy różne możliwości, byle dotrzeć do celu.

Najbardziej zapadające w pamięć są przypadki dzieci. Gdy dostajemy materiał od maluszków, automatycznie spinamy się bardziej, chyba odzywa się w nas wtedy syndrom matki Polki. Mieliśmy przypadek dziecka w wieku 3 lat. Pacjentka z nawracającymi zmianami skórno-śluzówkowymi, szczególnie w obrębie ust i śluzówki nosa. Występowały swędzące pęcherzyki obrazem odpowiadające zakażeniu opryszczką i delikatne owrzodzenia w obrębie zmian, z bólem i świądem. Matka zidentyfikowana jako nosiciel wirusa HSV, w czasie ciąży z aktywną chorobą. Zmiany zaczęły pojawiać się w wieku 2 lat. Z informacji uzyskanych od matki wiemy, że pierwszy wysiew nastąpił po infekcji górnych dróg oddechowych. Dodatnie wyniki przeciwciał przeciw HSV1, krótkoterminowa odpowiedź na leczenie przeciwwirusowe. Wynik histopatologiczny niejednoznaczny, z adnotacją, że obraz może odpowiadać zmianom spowodowanym HSV. Dostaliśmy materiał z jednostki zewnętrznej z dokładnym opisem w kierunku wykonania diagnostyki przeciwwirusowej. Wyniki dodatnie w kierunku HSV. Jednak nie podobało nam się stwierdzenie: krótkoterminowa odpowiedź na leczenie. Po przeanalizowaniu danych i kontakcie z lekarzem kierującym zaproponowaliśmy diagnostykę w kierunku chorób pęcherzowych. Był to strzał w dziesiątkę. Odpowiedziała desmogleina 1, jednak nie było tak różowo, ponieważ na przełyku małpy nie zaobserwowałyśmy odpowiedniego typu świecenia. Przeciwciała przeciw Des1 potwierdzaliśmy zarówno IIFT, jak i metodą ELISA. W obu przypadkach wynik dodatni. Poprosiliśmy lekarza o pobranie wycinka z okolicy zmian celem wykonania badania immunopatologicznego, tym bardziej że otrzymaliśmy dodatni wynik specyficznych przeciwciał i brak odpowiedzi na przełyku małpy. Zgodnie z podejrzeniami w DIF zaobserwowaliśmy silne świecenie w przestrzeniach międzykomórkowych. Gdyby nie odpowiedź przeciwciał anty-Des1, w dalszym ciągu dziecko byłoby z błędnym rozpoznaniem i leczeniem. Wiemy, że nasze działania przyniosły efekt, gdyż pacjentka i jej matka przyjechały osobiście podziękować.

Państwa laboratorium dysponuje bardzo szerokim wachlarzem badań w zakresie immunologii. Jak rozwijało się to zaplecze i jak dziś przekłada się to na możliwości diagnostyczne oraz opiekę nad pacjentem?

Trzeba przyznać, że rozwój naszego zaplecza trwał wiele lat i był procesem wieloetapowym, poczynając od monotestów, które były wykonywane całkowicie manualnie, sukcesywnie przechodząc do bardziej zaawansowanych procesów technologicznych, metodycznych i substratowych. Jak w każdej dziedzinie, również w immunologii następował rozkwit. Początkowo wykorzystywaliśmy proste testy z pojedynczymi substratami, co przekładało się na wydłużenie procesu identyfikacji. W miarę rozwoju i upływu czasu nasza diagnostyka rozszerzała swoje możliwości. Testy w diagnostyce zmieniały format na wieloparametrowy, więc mogliśmy wdrażać zaawansowane technologie, jak immunoblot, doskonalić ocenę testów opartych na immunofluorescencji pośredniej, wykorzystywać metodę ELISA w uproszczonej i złożonej wersji antygenowej. Oczywiście ważna dla naszego rozwoju była automatyzacja procesów diagnostycznych. W miarę postępu wdrażaliśmy więcej parametrów, co przekładało się na czas wykonania przez tzw. czynnik ludzki. Automatyzacja procesów pozwoliła na zwiększenie wydajności. Byliśmy i jesteśmy w stanie robić więcej i szybciej z korzyścią dla pacjenta.

Co to oznacza dla diagnostyki?

Wszystko!

Pacjent szybciej otrzymuje diagnozę, co pozwala na wcześniejsze wykrycie chorób i co za tym idzie – wdrożenie odpowiedniego leczenia, które ma szansę ratować, a nie tylko ograniczać się do poprawy jakości życia, kiedy już nie ma co zbierać. Klinicystom daje to precyzyjniejsze narzędzie do monitorowania przebiegu choroby i skuteczności wdrożonego leczenia, pozwala na szybszą reakcję.

Wszystko to składa się na większy komfort pacjenta i poprawę opieki nad nim.

Dziękuję za rozmowę.

Rozmawiała: Małgorzata Kozłowska