Diagnostyka przeciwciał anty-SARS-CoV-2 – testy ELISA czy testy kasetkowe?

Jak wygląda diagnostyka zakażeń SARS-CoV-2?

Zgodnie z aktualnymi zaleceniami Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) do diagnostyki infekcji SARS-CoV-2 stosuje się testy oparte o metodę RT-PCR, które wykrywają w badanej próbce materiał genetyczny nowego koronawirusa (1). Dopełnieniem rekomendowanej metody diagnostycznej są testy serologiczne, które wykrywają specyficzne przeciwciała anty-SARS-CoV-2 (2). Testy serologiczne odgrywają kluczową rolę w późniejszej fazie zakażenia. Badania wykrywające specyficzne przeciwciała mogą stanowić uzupełnienie bezpośredniej metody wykrywania koronawirusa (RT-PCR), wydłużając czas, w którym możliwe jest przeprowadzenie wiarygodnej diagnostyki (1).

Jakie testy służą do diagnostyki serologicznej?

Na rynku dostępne są testy serologiczne oparte na metodzie immunoenzymatycznej ELISA (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), np. test EUROIMMUN Anty-SARS-CoV-2 ELISA, oraz testy kasetkowe oparte na analizie immunochromatograficznej (ang. Lateral-Flow Immunochromatographic Assay), często nazywane szybkimi testami diagnostycznymi (ang. rapid diagnostic tests) (3).

Kompleksowa diagnostyka zakażeń SARS-CoV-2 – pobierz broszurę

Na czym polegają testy do oznaczania przeciwciał?

Testy ELISA są przeznaczone do laboratoriów medycznych i od lat stosowane są jako wiarygodne narzędzia diagnostyczne służące do wykrywania przeciwciał w przypadku wielu chorób zakaźnych. Każdy zestaw testowy EUROIMMUN Anty-SARS-CoV-2 ELISA zawiera płytkę mikrotitracyjną z oddzielnie odłamywanymi studzienkami reakcyjnymi, które opłaszczone są wysokospecyficznym, rekombinowanym białkiem strukturalnym S1 SARS-CoV-2. W pierwszym etapie analizy antygen znajdujący się na dnie studzienki inkubowany jest z rozcieńczonymi próbkami (surowicą lub osoczem) pacjentów. W przypadku obecności specyficznych przeciwciał w badanym materiale dochodzi do powstania kompleksu antygen–przeciwciało. Związane przeciwciała wykrywa się podczas drugiego etapu inkubacji z przeciwciałami antyludzkimi znakowanymi enzymem (koniugat enzymatyczny), który następnie katalizuje barwną reakcję z roztworem substratu. Intensywność barwy jest proporcjonalna do stężenia przeciwciał w surowicy (4).

Testy kasetkowe opierają się na metodzie immunochromatograficznej i służą do wstępnej detekcji przeciwciał skierowanych przeciwko SARS-CoV-2. Naniesiona na papier chromatograficzny badana próbka (krew włośniczkowa, żylna, surowica, osocze) przepływa wzdłuż nitrocelulozowej membrany. Jeśli obecne są w niej przeciwciała skierowane przeciwko nowemu koronawirusowi, zostaną one związane. Na tym etapie formowany jest kompleks z antygenem znakowanym złotem koloidalnym. Następnie kompleks ten przemieszcza się pod wpływem chromatografii do obszaru reakcji, gdzie dochodzi do kontaktu ze specyficznymi antyludzkimi przeciwciałami, które są unieruchomione na powierzchni membrany. W wyniku reakcji tworzy się złożony kompleks, który prowadzi do pojawienia się wybarwionej linii bądź kropki (3) (5).

Jakie są różnice pomiędzy testami ELISA a testami kasetkowymi?

Każde oznaczenie badanej próbki metodą ELISA przebiega z zachowaniem identycznej procedury i warunków inkubacji. Wyniki reakcji odczytuje się spektrofotometrycznie przy określonej długości fali. W przypadku testu ELISA Anty-SARS-CoV-2 firmy EUROIMMUN na podstawie wartości absorbancji badanej próbki oraz kalibratora cut-off obliczany jest współczynnik RATIO, w wyniku przeprowadzonej analizy otrzymuje się wynik półilościowy. Odczytywana wartość absorbancji jest proporcjonalna do poziomu przeciwciał w próbce. Opracowana dokładna metodyka badań gwarantuje najwyższą wiarygodność badania.

Testy kasetkowe mogą być wykorzystywane w laboratoriach medycznych, ale na rynku są również dostępne testy do użytku domowego. W przypadku testów kasetkowych wyniki reakcji odczytuje się na podstawie wzrokowej oceny poziomu intensywności wybarwienia linii lub kropki testowej. W związku z tym każdy wynik jest jedynie jakościowy i jest obarczony możliwym błędem ludzkim. Poziom przeciwciał anty-SARS-CoV-2 nie może być oceniony za pomocą testu kasetkowego, gdyż intensywność wybarwienia linii testowej nie musi mieć związku z poziomem specyficznych przeciwciał w badanej próbce.

Przy wyborze testu serologicznego do diagnostyki zakażeń koronawirusem SARS-CoV-2 należy zwrócić uwagę na zastosowany antygen, ponieważ determinuje on czułość i specyficzność badania. Wybór właściwego antygenu ma kluczowe znaczenie dla otrzymania wiarygodnego wyniku i zminimalizowania możliwości otrzymania nieprawidłowych wyników (fałszywie pozytywnych/negatywnych). W testach EUROIMMUN Anty-SARS-CoV-2 ELISA jako antygen zastosowano rekombinowaną podjednostkę S1 białka strukturalnego S SARS-CoV-2. Zastosowanie wysokospecyficznego antygenu S1 zapewnia wiarygodną diagnostykę infekcji SARS-CoV-2. W przypadku testów kasetkowych bardzo często brak jest szczegółowych informacji o zastosowanym w teście antygenie, stąd wyniki tego typu badania należy interpretować z ostrożnością.

Zestawienie najważniejszych różnic pomiędzy testem ELISA oraz testem kasetkowym do diagnostyki infekcji SARS-CoV-2 (3) (4) (5) (6) (7) (8)
Parametr	Test EUROIMMUN Anty-SARS-CoV-2 ELISA	Test kasetkowy
Metoda	immunoenzymatyczna	immunochromatograficzna
Rodzaj testu	półilościowy	jakościowy
Postać wyniku	liczbowa (wiarygodny wynik, określający poziom wykrytych przeciwciał)	wybarwienie linii testowej (bez informacji o poziomie przeciwciał)
Sposób odczytu wyniku	kolorymetryczny, odczyt absorbancji (automatyczny odczyt = pewny wynik)	wzrokowy (możliwy błąd ludzki)
Badany materiał	surowica lub osocze	krew włośniczkowa, żylna, surowica, osocze
Objętość próbki	10 μl	zwykle 10–20 μl
Skład zestawu	• studzienki reakcyjne opłaszczone wysokospecyficznym antygenem S1 SARS-CoV-2 • kalibrator • kontrola pozytywna i negatywna • koniugat enzymatyczny • bufor do płukania • bufor do rozcieńczania próbek • roztwór chromogenu/substratu • roztwór przerywający reakcję	• plastikowe kasetki pomiarowe złożone m.in. z membrany nitrocelulozowej oraz podłoża ze złotem koloidalnym (często brak informacji o zastosowanym w teście antygenie) • pipetki • bufor reakcyjny
Czas pomiaru	120 min	zwykle 10–20 min (wynik po upływie czasu określonego w instrukcji należy uznać za nieważny)
Czułość	określona na licznej grupie badanej: • klasa IgA: 100% • klasa IgG: 93,8%	• różna w zależności od producenta (często określona na bardzo małej grupie badanej)
Swoistość	określona na licznej grupie badanej: • klasa IgA: 92,4% • klasa IgG: 99,6%	• różna w zależności od producenta (często określona na bardzo małej grupie badanej)
Możliwe czynniki interferujące	określone: • próbki hemolityczne, hiperlipemiczne i z hiperbilirubinemią nie wykazały wpływu na wynik aż do stężenia 10 mg/ml hemoglobiny, 20 mg/ml trójglicerydów i 0,4 mg/ml bilirubiny	brak danych
Współczynnik zmienności (CV)	określony	brak danych
Certyfikaty	CE-IVD, EUA-FDA	CE-IVD lub brak (w zależności od producenta)

Dlaczego warto wykonać test EUROIMMUN Anty-SARS-CoV-2 ELISA?

Testy EUROIMMUN Anty-SARS-CoV-2 ELISA IgA, IgG jako jedne z pierwszych w Unii Europejskiej otrzymały certyfikat zgodności CE-IVD oraz są pierwszymi testami serologicznymi na rynku amerykańskim, które otrzymały certyfikat EUA-FDA po niezależnej i rygorystycznej ocenie.

Firma EUROIMMUN posiada w swojej ofercie testy diagnostyczne oparte o metodę ELISA, które są od lat stosowane zarówno w rutynowej diagnostyce, jak i w badawczych ośrodkach referencyjnych. Ich wiarygodność sprawdzana jest podczas kontroli, zarówno wewnątrzlaboratoryjnych, jak i zewnątrzlaboratoryjnych, inaczej niż w przypadku testów kasetkowych. Liczne laboratoria w Polsce są wyposażone w sprzęty firmy EUROIMMUN służące do automatycznej inkubacji i analizy próbek metodą ELISA, co znacząco zwiększa liczbę wykonywanych badań podczas jednej serii. W małych laboratoriach możliwa jest natomiast manualna inkubacja, gdyż procedura testu ELISA jest prosta do wykonania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego.

Zalety testów EUROIMMUN Anty-SARS-CoV-2 ELISA:

wysoka specyficzność testu, dzięki zastosowaniu rekombinowanego antygenu – podjednostki S1 białka strukturalnego S SARS-CoV-2
niewielka liczba reakcji krzyżowych – podjednostka S1 ma najniższą homologię z analogicznymi rejonami innych koronawirusów patogennych dla człowieka
najwyższa czułość przy równoległej detekcji specyficznych przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w klasie IgA oraz IgG
prosty schemat inkubacji, znana metodyka
wynik półilościowy – możliwość określenia poziomu przeciwciał
weryfikacja przebiegu procesu inkubacji – zawarte w zestawie surowice kontrolne
charakterystyka testu opracowana w oparciu o solidne i rozległe dane (blisko 1250 próbek)
certyfikaty: CE-IVD, EUA-FDA
możliwość pełnej automatyzacji – zwiększenie przepustowości laboratorium

Wielu ekspertów z całego świata alarmuje, że testy serologiczne są konieczne do zrozumienia epidemiologii COVID-19 (9). Kluczowe znaczenie ma tu wybór wiarygodnych, sprawdzonych i precyzyjnych testów. Należy jednak pamiętać, że zawsze niezbędna jest interpretacja wyników testów laboratoryjnych przez lekarza, który indywidualnie i kompleksowo ocenia stan pacjenta na podstawie wywiadu klinicznego, objawów, występujących chorób towarzyszących oraz danych epidemiologicznych.

Piśmiennictwo

Zhao J. i wsp. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. [Online] 28 03 2020. [Zacytowano: 21 05 2020.] https://doi.org/10.1093/cid/ciaa344.
Li R. i wsp. Substantial undocumented infection facilitates the rapid dissemination of novel coronavirus (SARS-CoV-2). Science. [Online] 01 03 2020. [Zacytowano: 21 05 2020.] https://science.sciencemag.org/content/368/6490/489.
Muszyńska M., Kuzdraliński A. Szybkie testy immunochromatograficzne. e-biotechnologia.pl. [Online] 06 04 2013. [Zacytowano: 16 04 2020.] https://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Szybkie-testy-immunochromatograficzne/.
EUROIMMUN. Anty-SARS-CoV-2 ELISA (IgA) – instrukcja. 2020.
Hightop. SARS-CoV-2 IgM/IgG Antibody Rapid Test – instrukcja. 2020.
Nowość! Szybki test do wykrywania przeciwciał na koronawirusa 2019-nCOV. BioMaxima. [Online] [Zacytowano: 16 04 2020.] https://biomaxima.com/100-szybkie-testy.html.
Test na koronawirusa SARS-CoV-2 IgM/IgG. OneDayClinic. [Online] [Zacytowano: 16 04 2020.] https://www.onedayclinic.pl/testy-covid19/.
Lubelska firma stworzyła test na koronawirusa. „Wynik po 10 minutach”. Wprost. Zdrowie i Medycyna. [Online] 02 03 2020. [Zacytowano: 16 04 2020.]
https://zdrowie.wprost.pl/koronawirus/10303465/lubelska-firma-stworzyla-test-na-koronawirusa-wynik-po-10-minutach.html.
Vogel G. ‘These are answers we need.’ WHO plans global study to discover true extent of coronavirus infections. Science. [Online] 02 04 2020. [Zacytowano: 16 04 2020.] https://www.sciencemag.org/news/2020/04/these-are-answers-we-need-who-plans-global-study-discover-true-extent-coronavirus#.