Pandemia wywołana przez nowego koronawirusa jest obecnie jednym z największych problemów zdrowotnych na świecie. Z powodu braku specyficznych objawów rozpoznanie choroby wywoływanej przez SARS-CoV-2 tylko w oparciu o obraz kliniczny jest niemożliwe. Aby potwierdzić zakażenie nowym koronawirusem, konieczne jest wykonanie badań laboratoryjnych. W diagnostyce laboratoryjnej COVID-19 wykorzystywane są 2 rodzaje badań: genetyczne (diagnostyka bezpośrednia) i serologiczne (diagnostyka pośrednia). Z filmu dowiesz się, czym różni się diagnostyka bezpośrednia SARS-CoV-2 od pośredniej, jakie wady i zalety ma każda z nich, którą metodę wybrać w zależności od fazy infekcji.

0:39 Jakie testy wykonywać w diagnostyce zakażeń koronawirusem SARS-CoV-2?

1:44 Diagnostyka molekularna COVID-19

2:13 Diagnostyka serologiczna COVID-19

2:51 Kiedy wykonać badanie?

5:00 Zalety i wady testów typu RT-PCR w diagnostyce COVID-19

6:44 Zalety i wady testów serologicznych w diagnostyce COVID-19

9:59 Genetyka czy serologia – jak diagnozować zakażenia SARS-CoV-2?

Informacje przedstawione w filmie pochodzą z artykułów:

Zhao J. i wsp. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus. medRxiv (Preprint). [Online] 03 03 2020. [Zacytowano: 21 04 2020.] https://doi.org/10.1101/2020.03.02.20030189.

World Health Organisation. [Online] 11 03 2020. [Zacytowano: 21 04 2020.] https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/events-as-they-happen.

Zhou P. i wsp. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7.

Euroimmun Polska. Test EUROIMMUN EURORealTime SARS-CoV-2. [Zacytowano: 21 04 2020.] https://euroimmun.pl/blog/test-euroimmun-eurorealtime-sars-cov-2/.

Euroimmun Polska. Diagnostyka serologiczna w COVID-19. [Zacytowano: 21 04 2020.] https://euroimmun.pl/blog/wp-content/uploads/2020/04/Diagnostyka-serologiczna-w-COVID-19-1.pdf.

Liu L. i wsp. A preliminary study on serological assay for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in 238 admitted hospital patients. medRxiv (Preprint). [Online] 2020. doi: 10.1101/2020.03.06.20031856.

Okba N.M.A. i wsp. SARS-CoV-2 specific antibody responses in COVID-19 patients. medRxiv (Preprint). [Online] 2020. doi: 10.1101/2020.03.18.20038059.

Lu R. i wsp. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 2020, 395(10224), strony 565–574.

Jakie testy wykonywać w diagnostyce zakażeń koronawirusem SARS-CoV-2?

W obecnej sytuacji epidemiologicznej najbardziej istotne dla zahamowania rozprzestrzeniania się SARS-CoV-2 jest jak najwcześniejsze wykrywanie zakażenia. Z powodu braku specyficznych objawów rozpoznanie choroby wywoływanej przez SARS-CoV-2 tylko w oparciu o obraz kliniczny jest niemożliwe. Aby potwierdzić zakażenie nowym koronawirusem, konieczne jest wykonanie badań laboratoryjnych.

Istnieją dwa typy badań, które są wykorzystywane w diagnostyce laboratoryjnej COVID-19: genetyczne (zaliczane do diagnostyki bezpośredniej), np. test EUROIMMUN EURORealTime SARS-CoV-2, i serologiczne (zaliczane do diagnostyki pośredniej), np. testy EUROIMMUN Anty-SARS-CoV-2 ELISA (IgA, IgG). Testy bezpośrednie i pośrednie różnią się zastosowaniem i metodologią.

Diagnostyka molekularna COVID-19

Materiałem do badania genetycznego jest wymaz z górnych dróg oddechowych lub, jeśli otrzymanie takiego materiału jest możliwe, próbki pobrane z dolnych dróg oddechowych (np. aspiraty tchawicze oraz popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe). Testy genetyczne pozwalają na wykrycie materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w badanej próbce.

Diagnostyka serologiczna COVID-19

Próbkę do badania serologicznego stanowi surowica lub osocze. Serologiczne testy do diagnostyki COVID-19 wykrywają w badanej próbce specyficzne przeciwciała skierowane przeciwko nowemu koronawirusowi. Testy te nie służą zatem do bezpośredniego wykrywania wirusa, ale do potwierdzenia kontaktu z nim, czyli wykrycia specyficznych przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w badanej próbce. Pozytywny wynik testu serologicznego jest dowodem kontaktu pacjenta z wirusem.

Kiedy wykonać badanie?

W celu rozpoznania COVID-19, zgodnie z zaleceniami Światowej Organizacji Zdrowia, stosuje się testy amplifikacji kwasów nukleinowych, do których zalicza się m.in. metodę RT-PCR. Testy te wykrywają materiał genetyczny wirusa i umożliwiają potwierdzenie zakażenia już na kilka dni przed wystąpieniem objawów klinicznych, jednak najwyższą czułość uzyskują między 7. a 14. dniem od kontaktu z SARS-CoV-2, czyli wówczas gdy pacjent ma pierwsze objawy zakażenia. Badaniu RT-PCR powinny zostać poddane osoby spełniające kryteria przypadku podejrzanego COVID-19, które są szczegółowo opisane w zaleceniach.

Po upływie około tygodnia od wystąpienia pierwszych objawów klinicznych infekcji czułość diagnostyki genetycznej w zakażeniach SARS-CoV-2 stopniowo maleje z powodu spadku liczby cząstek wirusa w nabłonku dróg oddechowych. Wówczas pacjent może otrzymać wynik fałszywie ujemny, pomimo toczącej się infekcji.

W tej późniejszej fazie infekcji istotną rolę zaczynają odgrywać testy serologiczne wykrywające specyficzne przeciwciała anty-SARS-CoV-2, które wydają się być idealnym dopełnieniem metody RT-PCR, wydłużając czas umożliwiający przeprowadzenie wiarygodnej diagnostyki.

Przeciwciała specyficzne dla koronawirusa SARS-CoV-2 w klasie IgG są wykrywalne we krwi pacjenta około 10. dnia od czasu wystąpienia pierwszych objawów klinicznych, natomiast detekcja przeciwciał w klasie IgA jest możliwa zwykle nawet kilka dni wcześniej.

W badaniach serologicznych należy uwzględnić występowanie tzw. okna serologicznego. Jest to czas w pierwszej fazie infekcji, kiedy układ immunologiczny nie zdążył jeszcze wyprodukować wysokiego poziomu specyficznych dla patogenu przeciwciał. Wraz z czasem trwania/rozwojem? infekcji wzrasta poziom przeciwciał i dochodzi do serokonwersji, czyli zmiany ujemnego odczynu serologicznego na dodatni. Serokonwersję można wykryć w przypadku badania dwóch próbek pobranych od pacjenta w odstępie czasu. Świadczy ona o świeżej infekcji.

Zalety i wady testów typu RT-PCR w diagnostyce COVID-19

Testy genetyczne są obecnie jedynym zalecanym narzędziem diagnostycznym, które umożliwia ostateczne potwierdzenie ostrej infekcji SARS-CoV-2. Metoda RT-PCR umożliwia wykrycie zakażenia jeszcze przed wystąpieniem pierwszych objawów klinicznych, jak również u pacjentów bezobjawowych. Przy zastosowaniu odpowiednio dobranych starterów do reakcji PCR reakcje krzyżowe z innymi koronawirusami można niemal zupełnie wykluczyć. Przykładowym testem jest zestaw EUROIMMUN EURORealTime SARS-CoV-2. Test ten opiera się na strategii podwójnego celu, która polega na tym, że w jednej reakcji amplifikowane są 2 wysokospecyficzne regiony genów: ORF1ab i N-Gen, co zapewnia wysoką czułość (LoD = 1 cp/µl) i swoistość oznaczenia.

Testy molekularne stosowane w diagnostyce COVID-19 mają jednak pewne ograniczenia. Na wynik testu RT-PCR może wpłynąć wiele czynników, m.in.:

• Czas pobrania próbki do badania – testy genetyczne wykazują najwyższą czułość między 7. a 14. dniem od kontaktu z patogenem; pobranie w późniejszej fazie infekcji może skutkować fałszywie negatywnym wynikiem
• Sposób pobrania materiału do badania – nieprawidłowe pobranie wpływa na niską jakość uzyskanego materiału
• Transport materiału biologicznego do laboratorium – zbyt długi czas lub nieprawidłowe warunki przechowywania mogą skutkować fałszywie negatywnym wynikiem
• Poprawność wykonania analizy laboratoryjnej

Inne ograniczenia testów genetycznych to: stosunkowo wysoki koszt pojedynczego badania, dość długi czas oznaczenia oraz niewielka liczba przystosowanych do ich wykonywania laboratoriów, które muszą być wyposażone w specjalistyczny sprzęt. Pracownie genetyczne muszą spełniać restrykcyjne warunki prawne, a personel powinien być przeszkolony w zakresie wykonywania badań molekularnych.

Zalety i wady testów serologicznych w diagnostyce COVID-19

Testy serologiczne są wsparciem diagnostyki COVID-19 metodą RT-PCR – pozwalają na wydłużenie czasu, w którym można przeprowadzić rzetelną i wiarygodną diagnostykę. Stosowanie testów wykrywających przeciwciała metodą ELISA daje możliwość przebadania dużej liczby próbek w trakcie jednej serii. Dzięki temu jest to idealne narzędzie do badań epidemiologicznych, które umożliwią ustalenie rozpowszechnienia zakażenia w populacji, zaraźliwości, zapadalności i wirulencji nowego czynnika zakaźnego. Badania epidemiologiczne pozwolą również w przyszłości ustalić dokładny wskaźnik infekcji na dotkniętym epidemią obszarze oraz określić wskaźnik śmiertelności choroby.

Testy serologiczne znajdują również zastosowanie w tzw. dochodzeniach epidemiologicznych, czyli:

• badaniach osób, które przeszły zakażenie bezobjawowo lub skąpo objawowo i mogły być źródłem infekcji dla innych ludzi (tzw. „cisi” nosiciele)
• diagnozowaniu osób, które mogły mieć kontakt z zakażonymi SARS-CoV-2, ale nie spełniały kryteriów wykonania badań RT-PCR

Badania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 mogą mieć ponadto zastosowanie u osób szczególnie narażonych na zakażenie nowym koronawirusem, które z uwagi na wykonywaną pracę mogą być źródłem infekcji dla ludzi starszych i schorowanych (np. personel medyczny), oraz u osób mających kontakt w wieloma ludźmi (np. policja, personel sklepów, aptek).

Testy serologiczne są już stosowane w badaniach ozdrowieńców, w celu wykrycia osób z wysokim poziomem przeciwciał klasy IgG, które mogą być dawcami osocza stosowanego w terapii najcięższych przypadków COVID-19.

Podsumowując – niewątpliwą zaletą badań serologicznych jest możliwość ich szerokiego zastosowania w praktyce. Testy serologiczne oparte o metodę ELISA są przy tym łatwe do wdrożenia do laboratorium, gdyż sprzęt, który jest niezbędny do ich przeprowadzenia, znajduje się w większości medycznych laboratoriów diagnostycznych. Procedura inkubacji jest prosta i intuicyjna, a możliwość pełnej automatyzacji badania może znacznie zwiększyć liczbę wykonywanych testów w laboratorium. Niewątpliwą zaletą badań serologicznych, w porównaniu do testów molekularnych, jest stosunkowo niski koszt wykonania pojedynczego badania oraz krótszy czas przeprowadzenia oznaczenia.

Nie należy jednak zapominać, że przeciwciała anty-SARS-CoV-2 pojawiają się w organizmie chorego stosunkowo późno, dlatego testy serologiczne nie powinny zastępować diagnostyki bezpośredniej (RT-PCR) w diagnostyce świeżych zakażeń SARS-CoV-2.

Podczas interpretacji wyniku testu serologicznego należy również mieć na uwadze możliwość wystąpienia reakcji krzyżowych z przeciwciałami przeciwko innym patogennym dla człowieka koronawirusom. Wyniki fałszywie pozytywne mogą być też związane ze szczepieniem na grypę lub z towarzyszącymi chorobami autoimmunologicznymi. Dlatego też podczas wyboru testu serologicznego do diagnostyki zakażeń wirusem SARS-CoV-2 należy zwrócić uwagę na antygen zastosowany w teście, który ma istotne znaczenie dla czułości i specyficzności badania. W testach EUROIMMUN Anty-SARS-CoV-2 (IgA, IgG) ELISA zastosowano wysokospecyficzny, rekombinowany antygen S1 SARS-CoV-2. Wybór tego antygenu jest podyktowany m.in. niską homologią tej podjednostki białka S SARS-CoV-2 z analogicznymi regionami innych patogennych dla człowieka koronawirusów.

Genetyka czy serologia – jak diagnozować zakażenia SARS-CoV-2?

Podsumowując, zarówno testy genetyczne, jak i serologiczne służą do diagnostyki zakażeń koronawirusem SARS-CoV-2. Testy RT-PCR (zalecane przez WHO) znajdują zastosowanie szczególnie we wczesnej fazie infekcji, a więc w fazie replikacji wirusa, w której wykazują najwyższą czułość. Są to jedyne testy, które umożliwiają potwierdzenie ostrej infekcji. Testy serologiczne, służące do badania obecności specyficznych przeciwciał w surowicy lub osoczu, mają zastosowanie w okresie późniejszym, czyli już po wystąpieniu objawów COVID-19.