Firma Euroimmun posiada w swojej ofercie test T-SPOT.TB do diagnostyki latentnej postaci gruźlicy LTBI (ang. Latent Tuberculosis Infection). W tym filmie omawiamy możliwości automatyzacji poszczególnych etapów testu, takich jak izolacja i liczenie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej PBMC oraz zliczanie plamek powstałych na dnie studzienek testowych w celu interpretacji wyniku. Wyjaśniamy również krok po kroku, jak przebiega procedura wykonania testu T-SPOT.TB.

0:33 Procedura wykonania testu T-SPOT.TB

2:57 Automatyzacja izolacji PBMC

3:40 Zestaw T-Cell Select i urządzenie AutoPure do automatycznej izolacji PBMC

4:46 Urządzenia AutoPure dostępne w ofercie Euroimmun

5:03 Automatyzacja liczenia wyizolowanych komórek PBMC

5:43 Wykorzystanie analizatora hematologicznego do zliczania PBMC

6:54 Dostępne analizatory hematologiczne w ofercie Euroimmun

7:16 Automatyzacja zliczania plamek w celu interpretacji wyniku

7:49 Procedura automatycznego zliczania plamek

8:35 Czytnik płytek ELISPOT dostępny w ofercie Euroimmun

8:55 Podsumowanie

Jak przebiega procedura wykonania testu T-SPOT.TB?

Test T-SPOT.TB jest zestawem służącym do badania 24 pacjentów. Dla każdego z nich należy użyć 4 studzienek testowych. Odpowiedź komórkowa po stymulacji wysokospecyficznymi antygenami Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 i CFP-10 jest mierzona w dwóch osobnych studzienkach, a pozostałe dwie stanowią kontrolę negatywną i pozytywną.

W pierwszym etapie z próbki krwi pełnej pobranej od pacjenta należy wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej, czyli PBMC, w skład których wchodzą limfocyty T. Komórki te są następnie przemywane i liczone w celu przygotowania wystandaryzowanej zawiesiny dla każdego pacjenta. Odpowiednia ich liczba jest nanoszona na płytki mikrotitracyjne i stymulowana specyficznymi antygenami Mycobacterium tuberculosis. W przypadku wcześniejszego kontaktu pacjenta z patogenem dochodzi do produkcji interferonu gamma, który jest wychwytywany przez przeciwciała anty-interferon gamma, opłaszczone na dnie studzienek testowych. Następnie dodawane jest drugorzędowe przeciwciało wyznakowane enzymatycznie, które wiąże się z wychwyconą cytokiną, a potem także substrat, który w obecności enzymu przekształca się w barwny produkt. W następstwie tej reakcji na membranie w dołkach płytki powstają ciemnoniebieskie plamki. Każda plamka reprezentuje pojedynczą komórkę, która produkuje interferon gamma w odpowiedzi na antygeny stosowane w teście. Plamki należy zliczyć, aby określić liczbę efektorowych limfocytów T i prawidłowo zinterpretować wynik.

Test T-SPOT.TB można przeprowadzić w sposób manualny, jak również istnieje możliwość automatyzacji poszczególnych jego etapów. W zależności od potrzeb danego laboratorium można zautomatyzować proces izolacji komórek PBMC z zastosowaniem zestawu T-Cell Select i urządzeń AutoPure; etap liczenia komórek po izolacji, wykorzystując analizator hematologiczny; możliwe jest również użycie czytników płytek ELISPOT, w celu zliczenia plamek powstałych na dnie studzienek testowych i interpretacji wyniku. Rozwiązania do automatyzacji testu T-SPOT.TB można dopasować do wymagań i przepustowości każdego laboratorium.

Automatyzacja izolacji PBMC

Zestaw T-Cell Select i urządzenia AutoPure pozwalają na automatyczną izolację jednojądrzastych komórek krwi obwodowej PBMC, przy zastosowaniu ich magnetycznego sortowania.

Dzięki zestawowi T-Cell Select test T-SPOT.TB można przeprowadzić nawet do 54 godzin, czyli ponad 2 dni, od momentu pobrania próbek krwi od pacjentów, przechowując je w temperaturze pokojowej, bez konieczności ich dodatkowego procesowania.

Jak zatem wygląda etap izolacji PBMC przy użyciu zestawu T-Cell Select i urządzenia AutoPure?

T-Cell Select to zestaw odczynników składający się z buforu, dwóch rodzajów przeciwciał i kulek magnetycznych. AutoPure jest urządzeniem wyposażonym w magnes, który w duecie z zestawem T-Cell Select pozwala na automatyczną separację PBMC z pobranej od pacjenta próbki krwi.

W pierwszej kolejności do próbki krwi pełnej należy dodać bufor, aby ułatwić oczyszczanie komórek i przeprowadzić lizę erytrocytów. Następnie konieczne jest dodanie przeciwciał wiążących PBMC i magnetycznych kulek, wykazujących powinowactwo do kompleksów przeciwciała–PBMC. Właściwości kulek są wykorzystywane przez system separacji magnetycznej obecny w urządzeniu AutoPure do ekstrahowania PBMC z próbek, tak aby oczyszczone komórki móc wykorzystać dalej w teście T-SPOT.TB.

W porównaniu do izolacji manualnej, podczas automatycznej obróbki próbki z zastosowaniem zestawu T-Cell Select oraz urządzeń AutoPure można pominąć wiele kroków niezbędnych w trakcie izolacji manualnej i zredukować czas pracy nawet o 60%.

EUROIMMUN posiada w ofercie dwa urządzenia AutoPure: AutoPure10B, pozwalający na izolację komórek z 10 próbek krwi podczas 1 cyklu, i AutoPure 20B, działający na identycznej zasadzie, ale umożliwiający procesowanie aż do 20 próbek Jednocześnie.

Automatyzacja liczenia wyizolowanych komórek PBMC

Po wyizolowaniu komórek PBMC, konieczne jest ich zliczenie w celu przygotowania wystandaryzowanej zawiesiny komórkowej dla każdego pacjenta. Test T-SPOT.TB wymaga 250 000 komórek PMBC na jedną studzienkę reakcyjną. Reakcje przeprowadza się w 4 różnych dołkach, czyli łącznie na jednego pacjenta potrzebny jest milion komórek.

Liczenie komórek można przeprowadzić oczywiście w sposób manualny, zawieszając je w odpowiednim barwniku w komorach hemocytometrycznych i zliczając pod mikroskopem. Proces ten można jednak zautomatyzować i do liczenia komórek wykorzystać analizator hematologiczny. Urządzenie to służy do badania różnych komponentów krwi, czyli nie tylko leukocytów, ale również erytrocytów i trombocytów. Analizowane próbki są aspirowane przez urządzenie i rozdzielane na kilka małych frakcji. W niezależnych kanałach pomiarowych wykorzystanie różnych technologii, takich jak analiza oporności elektrycznej, rozpraszanie światła, fluorescencyjna cytometria przepływowa czy absorpcja światła oraz działanie specyficznych odczynników, umożliwia pomiar właściwości swoistych dla różnych komórek. Analizator następnie przetwarza zebrane dane i generuje wynik w formie raportu. Wyświetloną wartość wprowadza się do opracowanego przez producenta testu kalkulatora, który przelicza, jak przygotować odpowiednie rozcieńczenie próbki, żeby do każdego dołka nanieść po 250 000 komórek. Cały proces jest bardzo szybki i nie wymaga dużego zaangażowania ze strony personelu laboratorium oraz minimalizuje ryzyko błędu ludzkiego w procesie przygotowywania próbek.

Na rynku dostępnych jest wiele analizatorów różnych producentów, których wykorzystanie podczas procedury wykonania testu T-SPOT.TB znacząco usprawnia pracę. W naszej ofercie znajdą Państwo kompaktowe i łatwe w użyciu urządzenie Guava easyCyte 5HT, które pozwala na przeanalizowanie do 96 próbek w jednym cyklu.

Automatyzacja zliczania plamek w celu interpretacji wyniku

Możliwa jest również automatyzacja etapu zliczania plamek powstałych na dnie studzienek testowych w celu interpretacji wyniku. Każda plamka reprezentuje pojedynczą komórkę produkującą cytokinę, a ich liczba pozwala stwierdzić, czy pacjent posiada limfocyty T uwrażliwione na antygeny Mycobacterium tuberculosis. Do automatycznego odczytu płytek i zliczania plamek mogą posłużyć czytniki płytek ELISPOT.

W pierwszym etapie mikropłytkę należy umieścić w czytniku, aby została ona zeskanowana. Każda plamka jest fotografowana, a dane obrazu są przechwytywane, co pozwala na analizę ilościową i jakościową. W przypadku każdej plamki oceniana jest jej wielkość, kształt i intensywność wybarwienia. Wyniki są prezentowane jako dane liczbowe lub grafiki, a wygenerowany raport można wydrukować lub zarchiwizować w formie cyfrowej.

Czytniki płytek ELISPOT znacznie przyspieszają i ułatwiają analizę wyników, umożliwiając ich automatyczne odczytywanie i ocenę. Pozwalają wyeliminować błędy ludzkie, które mogą pojawić się przy odczycie i interpretacji, oraz zapewniają dokładność i powtarzalność wyników. Jednym z dostępnych na ryku rozwiązań jest czytnik BIOREADER® 7000 -E, który pozwala na uzyskanie nawet do 7 obrazów dla jednej studzienki reakcyjnej, a podwójne oświetlenie i telecentryczny obiektyw sprawiają, że zliczanie plamek jest niezwykle szybkie i efektywne.

Podsumowanie

Podsumowując, w teście T-SPOT.TB liczba komórek jest standaryzowana dla każdego pacjenta i usuwane są białka surowicy, które mogą niekorzystnie wpływać na wynik. Czyni to T-SPOT.TB bardzo czułym i swoistym testem do diagnostyki gruźlicy latentnej. Z tego względu nazywany jest on często testem do zadań specjalnych i znajduje zastosowanie w szczególności w diagnostyce LTBI u pacjentów z obniżoną odpornością.