Naukowcy z całego świata niestrudzenie pracują nad poznaniem mechanizmu chorobotwórczości wirusa SARS-CoV-2, wpływu wywołanej nim infekcji na organizm ludzki oraz przebiegu odpowiedzi immunologicznej na kontakt z tym patogenem. Badacze mają nadzieję, że dokładne poznanie budowy SARS-CoV-2 pomoże w opracowaniu skutecznego leku oraz szczepionki przeciwko COVID-19 i ułatwi kontrolę nad dalszym rozprzestrzenianiem się SARS-CoV-2. Zakłada się, że znajomość budowy nowego koronawirusa wpłynie na projektowanie wiarygodnych testów do diagnostyki serologicznej COVID-19. Wiemy już, że antygen zastosowany w testach serologicznych do diagnostyki zakażeń koronawirusem SARS-CoV-2 determinuje czułość i specyficzność badania.

1:20 Pochodzenie i budowa wirusa SARS-CoV-2

4:53 Jak przebiega infekcja komórek gospodarza przez wirusa SARS-CoV-2?

6:49 Jak znajomość budowy koronawirusa wpływa na projektowanie wiarygodnych testów do diagnostyki serologicznej COVID-19?

13:04 Podsumowanie

Obejrzyj także wykład prof. Marcina Drąga „Szczepionka przeciwko COVID-19 – czy pomoże zakończyć pandemię?”.

Pochodzenie i budowa wirusa SARS-CoV-2

Wirusy należące do rodziny Coronaviridae zostały sklasyfikowane do dwóch odrębnych podrodzin: Coronavirinae i Torovirinae. Podrodzina Coronavirinae podzielona została na cztery rodzaje: alfa-, beta-, delta- oraz gamma-koronawirusy. Najbardziej interesujące z medycznego punktu widzenia są rodzaje alfa oraz beta, do których należą wszystkie patogenne dla człowieka koronawirusy.

Do pierwszej izolacji wirusa SARS-CoV-2 wykorzystano komórki nabłonka dróg oddechowych pozyskane od zakażonych pacjentów. Początkowo wyizolowanego wirusa nazwano 2019-nCoV. Odkryto jednak, że wirus ten jest blisko spokrewniony z ludzkimi koronawirusami SARS-CoV oraz MERS-CoV. Ostatecznie wirusa nazwano SARS-CoV-2 i tym samym został on siódmym członkiem grupy ludzkich koronawirusów.

Naturalnym rezerwuarem koronawirusów są nietoperze i większość ludzkich koronawirusów pochodzi właśnie od tych zwierząt. Prawdopodobnie wirus SARS-CoV-2 także ma źródło u nietoperzy. Drzewo filogenetyczne oparte na całych genomach potwierdziło podobieństwo genetyczne między SARS-CoV-2 a beta-koronawirusem nietoperzy z podrodzaju Sarbecovirus. Wykazano, że całość sekwencji genomu nowego wirusa jest w 96,2% zgodna z koronawirusem związanym z nietoperzem z terenu prowincji Yunnan w Chinach.

Koronawirus SARS-CoV-2, podobnie jak pozostałe koronawirusy, jest wirusem osłonkowym. Jego genom stanowi jednoniciowe RNA o dodatniej polarności, złożone z blisko 30 tysięcy nukleotydów, co czyni go jednym z największych wirusów RNA.

Nukleokapsyd wirusa ma helikalną symetrię oraz dwuwarstwową białkowo-lipidową osłonkę. Cechą charakterystyczną jest tzw. korona wirusa, zbudowana z wystających na powierzchni wirusa glikoprotein tworzących „wypustki/kolce”.

Od końca 5’ RNA 60% sekwencji genomu stanowi gen ORF1a/ORF1b, który koduje białka wirusowe odpowiedzialne za jego replikację.

Pozostałą część genomu wirusowego stanowią geny odpowiedzialne za kodowanie białek strukturalnych oraz geny kodujące białka pomocnicze (ang. accessory proteins).

Na budowę koronawirusa SARS-CoV-2 składają się cztery główne białka strukturalne: białko nukleokapsydu (N), membranowe (M), otoczki (E) oraz powierzchniowe (S).

• N to białko nukleokapsydu – jedno z głównych białek wirusowych, pełniące zarówno funkcję ochronną dla dużej cząsteczki RNA, jak i aktywnie uczestniczące w modyfikacji procesów komórkowych i w replikacji wirusa.
• M to białko błonowe, będące głównym białkiem macierzy wirusa.
• E to białko osłonkowe, jest odpowiedzialne m.in. za formowanie wirionów.
• S, czyli glikoproteina powierzchniowa – to białko tworzące wypustki, kolce znajdujące się na powierzchni wirusa. Budowa glikoproteiny S różni się od analogicznej struktury występującej u innych znanych koronawirusów i potencjalnie może mieć wpływ na zwiększenie tropizmu wirusa SARS-CoV-2 do komórek docelowych oraz na jego wirulencję.

Jaki jest mechanizm infekcji komórek gospodarza przez wirusa SARS-CoV-2?

Białko S nowego koronawirusa jest zbudowane z dwóch podjednostek: podjednostki S1, która jest odpowiedzialna za wiązanie receptora na powierzchni komórki gospodarza, oraz podjednostki S2, odpowiedzialnej za zdolność do fuzji osłonki wirusa z błoną komórkową komórki gospodarza. Umożliwiają one wniknięcie materiału genetycznego wirusa do cytoplazmy komórek gospodarza.

SARS-CoV-2 wykazuje tropizm m.in do. komórek nabłonkowych, które znajdują się m.in. w drogach oddechowych oraz w układzie pokarmowym. Cząstki wirusa wiążą się do receptora ACE2, czyli konwertazy agniotensyny 2, który jest obecny na wielu ludzkich komórkach. Są to dla przykładu komórki:

• pęcherzyków płucnych typu II
• nabłonka jamy ustnej, przełyku, jelita krętego
• mięśnia sercowego
• kanalików proksymalnych nerek oraz nabłonka dróg moczowych

Podjednostka S1 białka S SARS-CoV-2 zawiera domenę wiążącą receptor, która poprzez związanie receptora ACE2 uczestniczy w fuzji SARS-CoV-2 z komórką gospodarza.

Drugim receptorem zaangażowanym w proces fuzji SARS-CoV-2 z komórką gospodarza jest TMPRSS2, czyli transmembranowa proteaza serynowa. Enzym ten jest odpowiedzialny za aktywację procesu fuzji osłonki wirusa z błoną gospodarza poprzez przecięcie białka S wirusa SARS-CoV-2, co umożliwia wejście wirusa do wnętrza komórki gospodarza.

Wirus SARS-CoV-2 prawdopodobnie może wykorzystywać dodatkowo integryny jako alternatywne receptory do efektywnego wnikania wirusa do wnętrza komórki gospodarza. Czynniki blokujące wiązanie integryn mogą stanowić obiecujący kierunek badań nad leczeniem farmakologicznym infekcji SARS-CoV-2.

Jak znajomość budowy koronawirusa wpływa na projektowanie wiarygodnych testów do diagnostyki serologicznej COVID-19?

Testy serologiczne pomagają poznać odpowiedź immunologiczną na SARS-CoV-2 i zidentyfikować osoby, które miały już kontakt z tym wirusem. W trakcie trwającej pandemii COVID-19 naukowcy niestrudzenie pracują nad poznaniem szczegółów odpowiedzi immunologicznej na SARS-CoV-2, w tym również czasu trwania i poziomu potencjalnej ochrony przed ponownym zakażeniem, jaką mogą prawdopodobnie zapewnić przeciwciała.

Opracowano już wiele testów służących do wykrywania przeciwciał przeciwko SARS-CoV-2. Jednak wyniki ostatnio opublikowanych badań sugerują, że wnioski, które można wysnuć na podstawie pozytywnego wyniku testu serologicznego, mogą zależeć od specyficzności wykrywanych przez test przeciwciał oraz od zastosowanego w teście antygenu. Wszystko zależy od tego, z jakimi antygenami koronawirusa reagują przeciwciała, które wykrywamy za pomocą danego testu. Testy serologiczne do diagnostyki przeciwciał są oparte najczęściej o antygen S lub N SARS-CoV-2.

Białko N odgrywa ważną rolę w transkrypcji i replikacji wirusowego RNA. Białko to jest silnie ekspresjonowane podczas procesu infekcji i dlatego wzbudza silną odpowiedź immunologiczną. Jednak homologia sekwencji białka N między SARS-CoV-2 i innymi ludzkimi koronawirusami jest wysoka.

Natomiast budowa glikoproteiny S różni się od analogicznej struktury występującej u innych znanych koronawirusów. Najniższą homologię wykazuje podjednostka S1 białka S SARS-CoV-2, stąd zastosowanie tej podjednostki jako antygenu w teście serologicznym zapewnia wysokospecyficzną detekcję przeciwciał anty-SARS-CoV-2.

Z kolei podjednostka S2 białka S, podobnie jak białko N, jest regionem wysoce konserwatywnym, dlatego też ich zastosowanie w testach serologicznych może powodować wysoki odsetek reakcji krzyżowych. Z tego względu zastosowanie jako antygenu izolowanej podjednostki S1 białka S skutkuje wysoką specyficznością testu serologicznego.

Dlaczego jeszcze podjednostka S1 jest tak ważna? Zawiera ona immunologicznie istotną domenę wiążącą receptor. Stanowi ona główny cel wiązania przeciwciał neutralizujących, mogących pełnić kluczową rolę w mechanizmach potencjalnej odporności na COVID-19.

Autorzy przeprowadzonego niedawno badania doszli do wniosku, że testy serologiczne oparte o białko S1 są potrzebne do identyfikacji osób z przeciwciałami neutralizującymi. Ostrzegają oni przed testami serologicznymi, które potwierdzają obecność jedynie przeciwciał przeciwko białku N, co ich zdaniem może wprowadzać pacjentów szukających odpowiedzi na pytanie o potencjalną odporność w błąd – mogą fałszywie wierzyć, że są odporni na ponowne zakażenie. W przypadku SARS-CoV-2 obserwuje się heterogenną odpowiedź przeciwciał w klasie IgG. Przeciwciała mogą być skierowane przeciwko białku S1 oraz przeciwko białku N, a te dwa rodzaje przeciwciał nie zawsze współwystępują ze sobą. W tym opublikowanym badaniu u pacjentów z przeciwciałami tylko przeciwko białku N, a bez przeciwciał przeciwko S1, nie wykazano obecności przeciwciał neutralizujących. Zdolność do neutralizacji wirusa SARS-CoV-2 była wyższa u osób z przeciwciałami przeciwko S1 w porównaniu z pacjentami, u których obecne były przeciwciała skierowane przeciwko białku N (odpowiednio: 86% i 74%). Co więcej, testy oparte na podjednostce S1 wykazały najwyższą skuteczność w odróżnianiu pacjentów zakażonych SARS-CoV-2 od osób zdrowych. U osób zdrowych odsetek wyników fałszywie pozytywnych był wyższy w przypadku testu opartego o antygen N w porównaniu do testu z antygenem S1.

Podsumowując, przy wyborze testu serologicznego do diagnostyki zakażeń koronawirusem SARS-CoV-2 należy zwrócić uwagę na zastosowany antygen, ponieważ determinuje on czułość i specyficzność badania.

 Białko N SARS-CoV-2 cechuje immunodominacja, co oznacza, że spośród wielu antygenów SARS-CoV-2 przeciwko temu białku odpowiedź immunologiczna rozwija się najsilniej. Zapewnia to wysoką czułość badania. Niestety, ze względu na wysoką homologię z innymi patogennymi dla człowieka koronawirusami, jego zastosowanie w testach serologicznych może powodować wysoki odsetek reakcji krzyżowych.

Tu rozwiązaniem może być zastosowanie specjalnego zaprojektowanego antygenu, modyfikowanego białka nukleokapsydu. Jest to nowatorski antygen, który zapewnia wysokoczułą i specyficzną detekcję przeciwciał anty-SARS-CoV-2. Zawiera wyłącznie unikalne dla SARS-CoV-2 fragmenty białka N. Ogranicza to do minimum ryzyko reakcji krzyżowych dzięki usunięciu niespecyficznych sekwencji aminokwasowych.

 Stosowany w testach serologicznych antygen N zapewnia wysokoczułą diagnostykę, natomiast zastosowanie jako antygenu podjednostki S1 białka S SARS-CoV-2 w teście serologicznym zapewnia wysokospecyficzną detekcję przeciwciał anty-SARS-CoV-2. Antygen S1 cechuje się najniższą homologią sekwencji z analogicznymi regionami innych patogennych dla człowieka koronawirusów. Stanowi też główny cel wiązania przeciwciał neutralizujących, mogących pełnić kluczową rolę w mechanizmach odporności przeciwko SARS-CoV-2. Jest to również główny antygen SARS-CoV-2, który jest wykorzystywany w badaniach mających na celu stworzenie skutecznej szczepionki na COVID-19.

Dlatego dobrym rozwiązaniem wydaje się być zastosowanie dwuetapowej strategii diagnostycznej. W pierwszym etapie należałoby zastosować wysokoczułe badanie testem w kierunku przeciwciał przeciwko białku N, a następnie, w przypadku otrzymania wyniku dodatniego/granicznego, zastosowanie drugiego, potwierdzającego testu. Tu zaleca się wysokospecyficzne oznaczenie przeciwciał przeciwko białku S1 wirusa SARS-CoV-2. O zastosowaniu dwuetapowej strategii diagnostycznej wspomniano ostatnio w najnowszych rekomendacjach CDC (Center for Disease Control). 

Podsumowanie

Badania serologiczne prowadzone na szeroką skalę są niezbędne do zrozumienia COVID-19 oraz stworzenia skutecznej metody walki z nowym koronawirusem. Ze względu na bezobjawowy przebieg zakażenia dzięki prowadzonym dziś populacyjnym badaniom serologicznym w przyszłości możliwe będzie określenie rzeczywistego rozpowszechnienia epidemii. Poznanie obecnego statusu serologicznego poszczególnych osób umożliwi ich obserwację oraz potwierdzenie przypuszczeń dotyczących zjawiska odporności i jej utrzymywania się w czasie. Ta wiedza jest z kolei konieczna do oceny skuteczności szczepień, na które tak bardzo liczymy. Prowadząc szeroko zakrojone badania serologiczne dziś, musimy jednak pamiętać o właściwym doborze narzędzi diagnostycznych, które cechować powinna maksymalna czułość i specyficzność.