Diagnostyka zakażenia Mycobacterium tuberculosis jest szczególnie wymagająca, kiedy badanie wykonuje się nie jednorazowo, lecz seryjnie, np. w wybranych grupach pracowników ochrony zdrowia. Wówczas kluczowe znaczenie ma nie tylko zdolność testu do wykrywania swoistej odpowiedzi immunologicznej na antygeny prątka gruźlicy, ale także stabilność i zgodność wyników uzyskiwanych w kolejnych oznaczeniach, wysoka swoistość oraz możliwość właściwej interpretacji wyników znajdujących się w pobliżu wartości odcięcia. W tym kontekście T-SPOT.TB stanowi szczególnie wartościowe narzędzie diagnostyczne. Dane pochodzące z dużych badań populacyjnych wskazują na wysoką zgodność kolejnych oznaczeń, niską częstość konwersji oraz bardzo niski odsetek wyników, których nie można jednoznacznie zinterpretować.

Charakterystyka testu T-SPOT.TB

T-SPOT.TB jest testem IGRA (ang. interferon-gamma release assay), w którym z próbki krwi izoluje się jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (ang. peripheral blood mononuclear cells, PBMC), a następnie do poszczególnych studzienek wprowadza się ich standaryzowaną liczbę. Po stymulacji antygenami ESAT-6 i CFP-10 zliczane są komórki efektorowe wydzielające IFN-γ. Antygeny te występują u prątków należących do kompleksu M. tuberculosis, natomiast nie są obecne w szczepach BCG, dlatego wcześniejsze szczepienie BCG nie powoduje dodatniego wyniku testu T-SPOT.TB. W odróżnieniu od innych testów IGRA, mierzących całkowite stężenie IFN-γ w próbce krwi pełnej, T-SPOT.TB ocenia odpowiedź na poziomie pojedynczych komórek przy standaryzowanej liczbie PBMC – ok. 250 000 komórek na studzienkę. Takie podejście pozwala lepiej kontrolować wpływ zmienności liczby limfocytów na wynik oznaczenia i jest szczególnie istotne u osób, u których występuje np. limfopenia.

Wyniki T-SPOT.TB w dużej populacji pracowników ochrony zdrowia

Poniżej przedstawiono dane z publikacji Kinga i wsp., która ukazała się na łamach „American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine”. Dotyczy ona zastosowania testu T-SPOT.TB w badaniach seryjnych. Autorzy przeanalizowali wyniki rutynowych badań przesiewowych pracowników ochrony zdrowia prowadzonych w 19 amerykańskich szpitalach.

Skala badania była wyjątkowo duża:

Zgodność wyników seryjnych na poziomie 98,9%

W przypadku badań seryjnych jednym z najważniejszych parametrów jest zgodność kolejnych oznaczeń. W omawianej publikacji aż 98,9% par wyników było zgodnych, co oznacza, że w kolejnym badaniu wynik ujemny pozostawał ujemny, a wynik dodatni pozostawał dodatni. W populacji o niskim prawdopodobieństwie nowego zakażenia częste zmiany wyniku z ujemnego na dodatni lub odwrotnie mogłyby prowadzić do dodatkowych konsultacji lekarskich, konieczności powtórzenia badania i ponownego pobrania krwi, a w niektórych przypadkach także do nieuzasadnionego wprowadzenia leczenia profilaktycznego. Wysoka zgodność wyników uzyskiwanych w kolejnych oznaczeniach wspiera przydatność testu T-SPOT.TB w badaniach seryjnych.

Częstość wyników dodatnich i konwersji w zależności od ryzyka epidemiologicznego

Średnia częstość konwersji, definiowanej jako zmiana wyniku z ujemnego na dodatni, wynosiła 0,8%. Co istotne, różniła się ona w zależności od profilu ryzyka badanej populacji. W 16 ośrodkach, w których T-SPOT.TB stosowano do badań całego personelu, wynosiła średnio ok. 0,6%, natomiast w 3 ośrodkach koncentrujących się na pracownikach z grup podwyższonego ryzyka była wyższa i wynosiła ok. 2,3%.

Podobną zależność obserwowano w przypadku ogólnej częstości wyników dodatnich: wynosiła ona średnio ok. 1,4% w ośrodkach badających cały personel i ok. 8,4% w ośrodkach obejmujących przede wszystkim osoby z grup podwyższonego ryzyka.

Jak interpretować rewersję na poziomie 17,6%

Średnia częstość rewersji wynosiła 17,6%. Warto jednak podkreślić, że wartość ta odnosi się wyłącznie do osób z wcześniejszym wynikiem dodatnim, u których w kolejnym badaniu uzyskano wynik ujemny, a nie do całej badanej populacji. Mimo występowania rewersji ogólna zgodność wyników seryjnych T-SPOT.TB była bardzo wysoka i wynosiła 98,9%.

Podobne obserwacje uzyskano również w niezależnym badaniu Meiera i Endersa, opublikowanym w 2021 r. w „European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases”, które obejmowało 5440 osób poddawanych seryjnemu testowaniu za pomocą T-SPOT.TB na przestrzeni 14 lat. Zgodność wyników wyniosła tam 95,6%, częstość konwersji 2,2%, a rewersji 16,7%. Dane te potwierdzają wysoką zgodność kolejnych oznaczeń T-SPOT.TB i są spójne z wynikami niezależnego badania przeprowadzonego w innej populacji.

Strefa graniczna – istotny element interpretacji T-SPOT.TB

Jedną z istotnych cech testu T-SPOT.TB jest możliwość wyodrębnienia kategorii wyniku granicznego. Ma to znaczenie zwłaszcza w badaniach seryjnych, ponieważ wyniki uzyskiwane w pobliżu punktu odcięcia mogą ulegać niewielkim wahaniom biologicznym i analitycznym, które przy kolejnym oznaczeniu mogą zmienić końcową klasyfikację wyniku. Zastosowanie strefy granicznej pozwala zmniejszyć ryzyko nadinterpretacji takich zmian jako rzeczywistych konwersji lub rewersji.

W omawianym badaniu przeanalizowano również wpływ usunięcia strefy granicznej i zastosowania pojedynczego punktu odcięcia. W takim wariancie średni odsetek wyników dodatnich wzrósł z 2,3% do 2,9%, częstość konwersji z 0,8% do 1,6%, a rewersji z 17,6% do 26,4%. Jednocześnie 79,8% wyników granicznych przy kolejnym badaniu uzyskało jednoznaczną klasyfikację jako dodatnie lub ujemne. Dane te wskazują, że strefa graniczna może ułatwiać interpretację wyników znajdujących się blisko punktu odcięcia i redukować ryzyko interpretowania niewielkich wahań jako rzeczywistej zmiany statusu wyniku.

Wysoka swoistość

W omawianej publikacji obserwowana swoistość T-SPOT.TB została oszacowana na co najmniej 98,6%. Autorzy przedstawili również analizę opartą na założeniu, że zgodne wyniki seryjne odzwierciedlają rzeczywisty status zakażenia, a wszystkie rewersje odpowiadają początkowym wynikom fałszywie dodatnim. Przy takim założeniu oszacowana swoistość wynosiła ok. 99,7%. Wysoka swoistość testu jest również związana z zastosowaniem antygenów ESAT-6 i CFP-10, dzięki czemu wcześniejsze szczepienie BCG nie wpływa na wynik w sposób charakterystyczny dla próby tuberkulinowej.

Niski odsetek wyników nieinterpretowalnych

W omawianej analizie spośród 42 155 oznaczeń T-SPOT.TB jedynie 155, czyli ok. 0,4%, nie dostarczyło wyniku możliwego do jednoznacznej interpretacji. Oznacza to, że w 99,6% przypadków uzyskano ważny wynik. Ma to szczególne znaczenie w programach badań przesiewowych obejmujących duże populacje, ponieważ wynik nieinterpretowalny może wiązać się z koniecznością powtórzenia oznaczenia, ponownego pobrania materiału oraz wydłużeniem procesu diagnostycznego.

Standaryzowana liczba komórek – ważna różnica analityczna

Jedną z najbardziej charakterystycznych cech testu T-SPOT.TB jest normalizacja liczby jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) używanych w oznaczeniu. W przeciwieństwie do testów wykonywanych bezpośrednio z określonej objętości pełnej krwi w procedurze testu T-SPOT.TB najpierw izoluje się komórki PBMC, tak aby oznaczenie przeprowadzić przy ich zdefiniowanej liczbie. Dzięki temu wynik przedstawia liczbę swoistych komórek wydzielających IFN-γ w kontrolowanej populacji komórkowej. Może to być szczególnie istotne w grupach, w których liczba limfocytów jest zmienna, np. u pacjentów w immunosupresji.

Podsumowanie – T-SPOT.TB w badaniach seryjnych

Ocena przydatności testu IGRA, szczególnie w badaniach seryjnych, powinna uwzględniać nie tylko jego parametry diagnostyczne, ale również zgodność kolejnych wyników, częstość konwersji i rewersji, sposób interpretacji wyników w pobliżu punktu odcięcia oraz zgodność obserwowanych wyników z ryzykiem epidemiologicznym. W tych obszarach T-SPOT.TB dysponuje dobrze udokumentowanymi danymi. W omawianej publikacji wykazano 98,9% zgodności wyników seryjnych, średnią częstość konwersji na poziomie 0,8%, obserwowaną swoistość wynoszącą co najmniej 98,6% oraz jedynie 0,4% wyników, których nie można było jednoznacznie zinterpretować. Ponadto częstość konwersji pozostawała związana z różnicami w ryzyku epidemiologicznym. W połączeniu ze standaryzacją liczby analizowanych PBMC, wykorzystaniem swoistych antygenów ESAT-6 i CFP-10 oraz możliwością wyodrębnienia wyniku granicznego cechy te wspierają zastosowanie T-SPOT.TB w seryjnej ocenie odpowiedzi immunologicznej związanej z zakażeniem M. tuberculosis.

Piśmiennictwo

1. King TC, Upfal M, Gottlieb A, et al. T-SPOT.TB Interferon-γ Release Assay Performance in Healthcare Worker Screening at Nineteen U.S. Hospitals. Am J Respir Crit Care Med. 2015;192(3):367–373. doi:10.1164/rccm.201501-0199OC.
2. Meier T, Enders M. High reproducibility of the interferon-gamma release assay T-SPOT.TB in serial testing. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2021;40(1):85–93. doi:10.1007/s10096-020-03997-3.
3. Rego K, Pereira K, MacDougall J, Cruikshank W. Utility of the T-SPOT.TB test’s borderline category to increase test resolution for results around the cut-off point. Tuberculosis. 2018;108:178–185. doi:10.1016/j.tube.2017.12.005.
4. Wang SH, Rajaram MVS, Trollip A, et al. Novel Automation of an Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay Testing Method: Comparable Diagnostic Performance of the T-SPOT.TB Test Using Manual Density Gradient Cell Isolation versus Automated Positive Selection with the T-Cell Select Kit. J Clin Microbiol. 2022;60. doi:10.1128/jcm.00551-22.
5. World Health Organization. WHO consolidated guidelines on tuberculosis. Module 3: Diagnosis – Tests for tuberculosis infection. Geneva: WHO; 2022.
6. Oh CE, Ortiz-Brizuela E, Bastos ML, Menzies D. Comparing the Diagnostic Performance of QuantiFERON-TB Gold Plus to Other Tests of Latent Tuberculosis Infection: A Systematic Review and Meta-analysis. Clin Infect Dis. 2021;73(5)–e1125.