Czego szukasz?

Filtrowanie

Zastosowanie wirusowych testów neutralizacji w ocenie osocza ozdrowieńców

27 maja, 2020
Paweł Krzemień

W ostatnim czasie pojawia się w mediach coraz więcej apeli do tzw. ozdrowieńców o oddanie osocza, które zostanie wykorzystane w leczeniu innych chorych. Osocze osób, które przechorowały zakażenie SARS-CoV-2, zawiera przeciwciała neutralizujące. Unieszkodliwiają one bezpośrednio zakaźną cząstkę wirusa, uniemożliwiając jej wniknięcie do komórek i dalsze namnażanie. Jednak nie wszystkie przeciwciała wytwarzane podczas reakcji immunologicznej mają właściwości neutralizujące. Niektóre z nich mogą nie mieć żadnego wpływu na zdolność wnikania wirusa do komórek, choć oczywiście każde związanie się przeciwciał z patogenem jest istotne, ponieważ już samo opłaszczenie cząsteczki wirusa przez przeciwciała wiążące antygen (opsonizacja) najczęściej doprowadza do aktywacji układu odpornościowego.

Według aktualnych doniesień w osoczu pobranym od ozdrowieńców, które będzie przetoczone chorym pacjentom, miano przeciwciał neutralizujących anty-SARS-CoV-2 powinno wynosić co najmniej 1:160. Do oznaczenia miana przeciwciał neutralizujących stosuje się standardowo wirusowe testy neutralizacji (ang. Virus Neutralisation Test, VNT). Klasyczny wirusowy test neutralizacji polega na przygotowaniu, na płytce 96-dołkowej, hodowli komórek wrażliwych na zakażenie danym wirusem. Następnym krokiem jest przygotowanie seryjnych rozcieńczeń inaktywowanej termicznie testowanej surowicy (lub roztworu zawierającego przeciwciała), zmieszanie jej z zawiesiną zawierającą określoną ilość cząstek zakaźnych wirusa i dodanie tak przygotowanej mieszaniny do założonej wcześniej hodowli. Całość jest inkubowana przez 2–3 dni. Po okresie inkubacji wynik jest odczytywany przez zbadanie każdej studzienki pod kątem obecności infekcji wirusowej, a właściwie oceny – czy i w jakim rozcieńczeniu surowicy infekcja wirusowa pozostaje zahamowana.

W przypadku niektórych wirusów dokonuje się oceny mikroskopowej efektu cytopatycznego (ang. cytopathic effect, CPE), który może obejmować zmianę morfologiczną zakażonych komórek lub ich lizę i pojawienie się w tym miejscu pustych przestrzeni, tzw. łysinek (ang. plaque). Dzięki zastosowaniu metod inżynierii molekularnej obecnie najczęściej do odczytu wyniku wykorzystuje się m.in. metody immunofluorescencyjne ujawniające obecność antygenu wirusowego w hodowanych komórkach. Ostateczny wynik badania, wyrażany jako miano przeciwciał neutralizujących w badanej próbce, oznacza ostatnie rozcieńczenie surowicy skutecznie neutralizujące zakażoną hodowlę, w odniesieniu do kontroli. W przypadku gdy w badanej próbce obecne jest wysokie stężenie przeciwciał, neutralizacja nastąpi nawet przy dużym rozcieńczeniu surowicy.

Warto w tym miejscu wspomnieć, że laboratorium wykonujące VNT musi mieć odpowiednie wyposażenie i poziom bezpieczeństwa BSL (ang. biosafety level). W przypadku niebezpiecznych wirusów o wysokiej zakaźności, do jakich zaliczamy SARS-CoV-2, wymagane byłoby laboratorium o poziomie bezpieczeństwa co najmniej BSL-3. Na szczęście inżynieria genetyczna umożliwia spore modyfikacje opisanej powyżej procedury, dzięki którym badacz nie jest wystawiony na ryzyko kontaktu z zakaźną formą wirusa, i badania SARS-CoV-2 można wykonywać nawet w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa BSL-2. Wykorzystuje się tu tzw. wektory pseudowirusowe, które są bezpieczniejsze dla badacza. Co istotne, w przypadku SARS-CoV-2 komórki używane w hodowli muszą mieć na swojej powierzchni receptor ACE2 (ang. Angiotensin-Converting Enzyme 2).

Podsumowując, z jednej strony testy VNT są możliwe do wykonania przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, ale z drugiej – są stosunkowo drogie i w porównaniu z innymi metodami serologicznymi pozwalającymi oznaczać poziom specyficznych przeciwciał (np. testami ELISA) wymagają zdecydowanie więcej czasu i pracy oraz umiejętności technicznych niezbędnych do przeprowadzenia takiej próby, chociażby ze względu na konieczność prowadzenia hodowli komórkowej.

Piśmiennictwo

  1. https://www.mp.pl/covid19/covid19-aktualnosci/233196,zgoda-mz-na-leczenie-covid-19-osoczem-ozdrowiencow
  2. http://www.biobest.co.uk/diagnostics/techniques/vnt-virus-neutralisation-tests.html
  3.  https://www.researchsquare.com/article/rs-24574/v1 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.30.20047365v1.full.pdf
  4. https://microbenotes.com/neutralization-test-introduction-and-types/
Krzemien

Paweł Krzemień

Kierownik Regionu (woj. świętokrzyskie, podkarpackie, małopolskie)

509 657 480

p.krzemien@euroimmun.pl

Masz pytanie dotyczące tego tematu? 





    Katalog produktów